Study of synaptic pahtology caused by FUS in amyotrophic lateral sclerosis

FUS引起肌萎缩侧索硬化症突触病理学研究

• 批准号: 22K07515
• 负责人: 横井 聡
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07515/
• 关键词: 筋萎縮性側索硬化症; シナプス; iPS細胞; CRISPR/Cas9; FUS

本研究は、申請者が発見したシナプス形成に関わるFUS-SynGAP mRNA安定化機構を起点に、確立したiPS細胞由来運動ニューロンやASOの実験系を用い、前回までの研究で明らかにならなかったFUSのSynGAPを含めたシナプス機能に関わるRNAの代謝異常機構を明らかにする。また、研究成果を直接患者に応用でき、かつ正確な対照群の設定のために、ゲノム編集で正常化した複数の患者サンプルとの対比により、FUS変異患者全体に共通した病態を解明する。今年度はFUS変異を有する患者リンパ球に対して、CRISPR/Cas9を用いて遺伝子編集を行った。その結果、効率的に正常化する方法を同定し、効率を簡便に把握できるalleic discriminationの方法も確立した。このシステムを用いると、ヘテロ変異から野生型への遺伝子編集はおおよそ５０％程度の確率で実施することができた、また、遺伝子編集時に蛍光色素のついたガイドRNAを用いることで、編集に必要なガイドRNAが導入できている細胞を簡便に同定することができ、蛍光強度が強い細胞がより編集効率が高くなることも発見した。この細胞をフローサイトメトリーにより蛍光強度の強い細胞を１細胞ずつ取り出し、培養することで正常化編集した単クローン株の取得に成功した。この株を用い、iPS細胞樹立を行い、患者株、正常編集株を得ることができた。このiPS細胞を用いて運動神経に分化させ機能解析を行う状態まで作成することができた。

This study is aimed at clarifying the mechanism of FUS-SynGAP mRNA stabilization related to the formation of FUS-SynGAP mRNA, establishing the origin of iPS cell movement and the use of ASO, and further studying the mechanism of RNA metabolism abnormality related to FUS-SynGAP mRNA function. The results of the study are used directly by patients, correctly set up for the study group, normalized for the study group, compared with the study group, and common for all patients with FUS differences. This year's FUS has a variety of patient profiles, CRISPR/Cas9 applications, and a compilation of genetic information. The method of normalization of the result and efficiency shall be determined, and the method of alleic discrimination shall be established simply. The gene assembly of wild-type DNA was performed with a 50% accuracy rate when the gene assembly was performed. The gene assembly was performed with a 50% accuracy rate when the gene assembly was performed. The gene assembly was performed with a 50% accuracy rate when the gene assembly was performed. The cells were isolated and cultured successfully, and the normalized cells were collected successfully. The iPS cells were established in the middle of the cell line, the patient cell line, and the normal cell line The iPS cells are used to analyze the function of motor neuron differentiation.