Study of synaptic pahtology caused by FUS in amyotrophic lateral sclerosis

本研究は、申請者が発見したシナプス形成に関わるFUS-SynGAP mRNA安定化機構を起点に、確立したiPS細胞由来運動ニューロンやASOの実験系を用い、前回までの研究で明らかにならなかったFUSのSynGAPを含めたシナプス機能に関わるRNAの代謝異常機構を明らかにする。また、研究成果を直接患者に応用でき、かつ正確な対照群の設定のために、ゲノム編集で正常化した複数の患者サンプルとの対比により、FUS変異患者全体に共通した病態を解明する。今年度はFUS変異を有する患者リンパ球に対して、CRISPR/Cas9を用いて遺伝子編集を行った。その結果、効率的に正常化する方法を同定し、効率を簡便に把握できるalleic discriminationの方法も確立した。このシステムを用いると、ヘテロ変異から野生型への遺伝子編集はおおよそ５０％程度の確率で実施することができた、また、遺伝子編集時に蛍光色素のついたガイドRNAを用いることで、編集に必要なガイドRNAが導入できている細胞を簡便に同定することができ、蛍光強度が強い細胞がより編集効率が高くなることも発見した。この細胞をフローサイトメトリーにより蛍光強度の強い細胞を１細胞ずつ取り出し、培養することで正常化編集した単クローン株の取得に成功した。この株を用い、iPS細胞樹立を行い、患者株、正常編集株を得ることができた。このiPS細胞を用いて運動神経に分化させ機能解析を行う状態まで作成することができた。

本研究は、申請者が発見したシナプス形成に関わるFUS-SynGAP mRNA安定化機構を起点に、確立したiPS細胞由来運動ニューロンやASOの実験系を用い、前回までの研究で明らかにならなかったFUSのSynGAPを含めたシナプス機能に関わるRNAの代謝異常機構を明らかにする。また、研究成果を直接患者に応用でき、かつ正確な対照群の設定のために、ゲノム編集で正常化した複数の患者サンプルとの対比により、FUS変異患者全体に共通した病態を解明する。今年度はFUS変異を有する患者リンパ球に対して、CRISPR/Cas9を用いて遺伝子編集を行った。その結果、効率的に正常化する方法を同定し、効率を簡便に把握できるalleic discriminationの方法も確立した。このシステムを用いると、ヘテロ変異から野生型への遺伝子編集はおおよそ５０％程度の確率で実施することができた、また、遺伝子編集時に蛍光色素のついたガイドRNAを用いることで、編集に必要なガイドRNAが導入できている細胞を簡便に同定することができ、蛍光強度が強い細胞がより編集効率が高くなることも発見した。この細胞をフローサイトメトリーにより蛍光強度の強い細胞を１細胞ずつ取り出し、培養することで正常化編集した単クローン株の取得に成功した。この株を用い、iPS細胞樹立を行い、患者株、正常編集株を得ることができた。このiPS細胞を用いて運動神経に分化させ機能解析を行う状態まで作成することができた。