予後不良AFP産生胃がんの二方向性分化の制御

α―フェトプロテイン(AFP)産生胃がんのオルガノイドは分化培地（Wnt, R-spondin, Noggin非添加）で培養を行うと、肝細胞様と腸管様の二方向性に分化することがこれまでの一細胞RNA解析により、明らかになった。この細胞分化がどの転写因子がどの様な機構で制御しているかを明らかにすることを本研究の目的としている。まず一細胞ATAC解析によりクラスター解析を行い、一細胞RNA解析とのデータ統合を行った。その結果、肝細胞様クラスターではHNF４Aモチーフが濃縮するが、腸管様細胞クラスターでの濃縮が見られなかった。この時、肝臓様クラスターと腸管様クラスターでHNF４Aの発現は大きくは変化しなかった。またHallmark解析により、これらの二つのクラスターの分岐でWNTシグナルおよびepithelial-mesenchymal transition（EMT）シグネチャーが濃縮しており、何らかの重要な変化が起きていると考えられた。そこで変化を引き起こすエンハンサーを同定するために、確実に発現変化とクロマチンオープン領域を紐づけることができる一細胞Multiome ATAC/RNA解析を行った。これにより、一細胞RNA解析で得られたクラスター特異的に亢進する遺伝子のエンハンサーおよびリプレッサーの探索が可能となった。また、ATAC解析よりモチーフ濃縮がみられるHNF４Aについて、アイソフォーム特異的なノックアウトを行い、それぞれのアイソフォームによる制御遺伝子の違いを同定するためにHNF4AのChIPを行った。この結果とMultiomeで得られた、エンハンサー領域との比較を行った。

α―フェトプロテイン(AFP)産生胃がんのオルガノイドは分化培地（Wnt, R-spondin, Noggin非添加）で培養を行うと、肝細胞様と腸管様の二方向性に分化することがこれまでの一細胞RNA解析により、明らかになった。この細胞分化がどの転写因子がどの様な機構で制御しているかを明らかにすることを本研究の目的としている。まず一細胞ATAC解析によりクラスター解析を行い、一細胞RNA解析とのデータ統合を行った。その結果、肝細胞様クラスターではHNF４Aモチーフが濃縮するが、腸管様細胞クラスターでの濃縮が見られなかった。この時、肝臓様クラスターと腸管様クラスターでHNF４Aの発現は大きくは変化しなかった。またHallmark解析により、これらの二つのクラスターの分岐でWNTシグナルおよびepithelial-mesenchymal transition（EMT）シグネチャーが濃縮しており、何らかの重要な変化が起きていると考えられた。そこで変化を引き起こすエンハンサーを同定するために、確実に発現変化とクロマチンオープン領域を紐づけることができる一細胞Multiome ATAC/RNA解析を行った。これにより、一細胞RNA解析で得られたクラスター特異的に亢進する遺伝子のエンハンサーおよびリプレッサーの探索が可能となった。また、ATAC解析よりモチーフ濃縮がみられるHNF４Aについて、アイソフォーム特異的なノックアウトを行い、それぞれのアイソフォームによる制御遺伝子の違いを同定するためにHNF4AのChIPを行った。この結果とMultiomeで得られた、エンハンサー領域との比較を行った。