Elucidation of pathogenesis of interactable lung diseases associated with dysregulated lipid metabolism

今年度は、ホスファチジルコリンの分解からコリン合成経路に関わるリン脂質分解酵素PNPLA6の発現の高い、肺癌細胞株(A549、H157細胞)、乳癌細胞株(MDA-MB231細胞）、腎がん細胞株(HEK293細胞)を用い検証を行なった。まず、PNPLA6の細胞内における発現について乳がん細胞株である検証を行なった。Immunocytochemistryを行った結果、PNPLA6の細胞内での発現は、小胞体であることが分かった。次に、細胞から、小胞体とミトコンドリアを分画しウェスタンブロットでPNPLA6の発現を検証した結果では、PNPLA6の発現は主にミトコンドリアであることがわかった。以上の結果よりPNPLA6の発現は主にMitochondria associated membrane(MAM)に発現している可能性が高いことが分かった。次に、PNPLA6を欠損させた細胞株を作成した。HEK293細胞、MDA-MB231細胞で、non targetとPNPLA6 ノックアウト細胞の細胞増殖をWST-1 assayにより検証を行なった。HEK293、MDA-MB231細胞両者で、著しい細胞増殖の低下が認められた。そこでHEK293細胞を用い細胞周期をDouble Thymidine Blockを用いG1/S期に同調させさらに検証を行なった。その結果、ノックアウト細胞ではS期に入る時点で細胞周期が遅れていることが分かった。HEK293細胞のnon targetとPNPLA6ノックアウト細胞を用い細胞内のコリン、グリセロホスホコリン（GPC）の産生量を検証したところ、ノックアウト細胞では、著しいコリン、GPCの低下が認められた。このことから、HEK293細胞の細胞内のコリン、GPCの産生はPNPLA6により調節されている可能性が示唆された。

今年度は、ホスファチジルコリンの分解からコリン合成経路に関わるリン脂質分解酵素PNPLA6の発現の高い、肺癌細胞株(A549、H157細胞)、乳癌細胞株(MDA-MB231細胞）、腎がん細胞株(HEK293細胞)を用い検証を行なった。まず、PNPLA6の細胞内における発現について乳がん細胞株である検証を行なった。Immunocytochemistryを行った結果、PNPLA6の細胞内での発現は、小胞体であることが分かった。次に、細胞から、小胞体とミトコンドリアを分画しウェスタンブロットでPNPLA6の発現を検証した結果では、PNPLA6の発現は主にミトコンドリアであることがわかった。以上の結果よりPNPLA6の発現は主にMitochondria associated membrane(MAM)に発現している可能性が高いことが分かった。次に、PNPLA6を欠損させた細胞株を作成した。HEK293細胞、MDA-MB231細胞で、non targetとPNPLA6 ノックアウト細胞の細胞増殖をWST-1 assayにより検証を行なった。HEK293、MDA-MB231細胞両者で、著しい細胞増殖の低下が認められた。そこでHEK293細胞を用い細胞周期をDouble Thymidine Blockを用いG1/S期に同調させさらに検証を行なった。その結果、ノックアウト細胞ではS期に入る時点で細胞周期が遅れていることが分かった。HEK293細胞のnon targetとPNPLA6ノックアウト細胞を用い細胞内のコリン、グリセロホスホコリン（GPC）の産生量を検証したところ、ノックアウト細胞では、著しいコリン、GPCの低下が認められた。このことから、HEK293細胞の細胞内のコリン、GPCの産生はPNPLA6により調節されている可能性が示唆された。