共有結合DNAアプタマーと増殖型レトロウイルスを応用した膵癌免疫療法の開発

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膵癌は腫瘍免疫活性が低く、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)の効果が乏しい現状であるが、共有結合DNAアプタマーを応用したICI(Immune checkpoint inhibit covalently-binding aptamers:ICIA)を開発し効果を検証する目的で研究を開始した。DNAアプタマーは生体内でDNAseの影響で速やかに分解されるため、効果が不安定という欠点がある。そこで共有結合を付加し安定したDNAアプタマーの作成の予備実験を施行した。Tabuchiらの論文（Chem. Commun.,2021,57,2483-86）を参考にthrombinに対するaptamer(thrombin binding aptamer:TBA) を共有結合化したアプタマーをコントロールとし、PD-L1に対する共有結合アプタマーを複数作成した。PD-L1に対するアプタマーの塩基配列は複数報告があるが、塩基数が比較的少なく複数検証された、aptPD-L1(Molecular Therapy-Nucleic Acids20165,e397)を選択し、16番目、20番目、45番目のT残基にwarheadを導入した共有結合型アプタマーを作成した。SDS-PAGEで観察すると、コントロールのTBAはthrombinとの結合が確認されたが、PD-L1とcovalent aptamer(T16,T20,T45,3riplet)の４種類はいずれも結合を確認できなかった。Native-PAGやSELEX bufferを用いたり、bufferの種類や条件設定を複数施行したが、いずれも結合を確認できなかった。そこで、癌細胞の増殖因子VEGF165に対する共有結合アプタマーを作成し実験系がワークしているかを検証した。結果、VEGF165共有結合アプタマー（T4,T17,T22）は３種ともVEGFとの結合が確認された。