Development of an Animal Model for Local Spinal Cord Foci of Okinawa ALS and Search for Surgical Treatment; Regulation of Mutant TFG Expression

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本申請研究では「脊髄局所における変異型TFG増加により沖縄型神経原性筋萎縮症 （沖縄型ALS）モデルラットを作成し、外科的遺伝子導入による治療法を開発する」ことである．具体的には以下の計画を推進中である．（１）脊髄局所における変異型TFG発現（TFGP285L）を増加させることで沖縄型ALSモデルを確立，（２）神経細胞死による運動機能変化と病理学的検討，（３）TFGP285L発現を外科的介入による沖縄型ALS病状進行停止を模索．低侵襲な成熟個体への遺伝子導入の方法として「軟膜下投与法」を開発し脊髄に障害を与えることなく効率的な遺伝子導入が実施可能となり、本申請研究でも採用している．予備実験として、使用するラット（SD系）を用い緑色蛍光タンパクGFPを過剰発現させる試みを実施した。本実験として以下の検討が進行中である。Ⅰ） プラスミド・ウイルスベクター作成：使用する変異TFGプラスミドは，培養神経細胞を用いてその細胞障害効果を判定したのち，AAV9を作成する．沖縄型ALSで報告された遺伝子変異（TFGP285L）をターゲットとしAAV9を作成を開始した．神経特異性を高めるためプロモーターとしてSynaptophysinを使用することとし、作成中である。Ⅱ ）ラット軟膜下投与によるTDP-43断片化C末端遺伝子導入とその評価：雄性ラットの胸椎Th11/12椎弓切除を施行する．その椎弓切除部分の硬膜を切開することで脊髄腰髄膨大部を露出する．軟膜を30G軟膜切開針で切開した後，軟膜下投与用鈍針を軟膜下挿入する．経注入針的にAAV9-Syn-mTFGP285Lを注入する．今後、14日毎に下肢運動機能とALSモデル動物で行われている電気生理学的検査（muscle fibrillation）の評価を行う。神経機能の客観的評価を行い、症状発現を観察する。