機能的な構造を有する腎・尿路再生への選択的細胞抽出法を応用した基礎的研究

遺伝子導入ES細胞であるPax2 ES細胞を、Glasgow MEMにFCS、2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、sodium pyruvate、LIFを加えたもので培養し、次にPax2 ES細胞をhanging drop法を用いembryoid body (EB)を形成させた。5日後にEBを再度ディッシュ上で数日間分化を進めて細胞塊を回収した。さらに5、10日目でEBを回収した。EBの遺伝子発現の確認をするため、ディッシュに平面培養したES細胞およびEBを0.25%トリプシンEDTA溶液にて回収し、mRNAを抽出、2-プロパノール、エタノールにて沈殿させ回収した。回収したEBに目的の遺伝子が発現しているかどうかをRT-PCR法を行った。回収したEBはRT-PCR法でPax2遺伝子が発現していることが確認できた。また他の腎発生の各段階で発現 して くる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認したところ、aquaporin-1、Integrin a8、BMP4、BMP7、Pax8、Podocinの発現上昇が認められた。そこ で、これらのEBをPax2発現細胞に対し、Pax2で標識した細胞を回収する条件でFACSを行い、細胞回収を行った。これらの細胞に対し、再度上記の遺伝子の発現が 上昇しているかをRT-PCR法で確認したところ、aquaporin-1の上昇が確認できた。今後他の培養条件を試し、違う性質の細胞が回収できるかを繰り返しながら、こ標的の細胞への分化が起こっているかの確認を継続する。

遺伝子導入ES細胞であるPax2 ES細胞を、Glasgow MEMにFCS、2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、sodium pyruvate、LIFを加えたもので培養し、次にPax2 ES細胞をhanging drop法を用いembryoid body (EB)を形成させた。5日後にEBを再度ディッシュ上で数日間分化を進めて細胞塊を回収した。さらに5、10日目でEBを回収した。EBの遺伝子発現の確認をするため、ディッシュに平面培養したES細胞およびEBを0.25%トリプシンEDTA溶液にて回収し、mRNAを抽出、2-プロパノール、エタノールにて沈殿させ回収した。回収したEBに目的の遺伝子が発現しているかどうかをRT-PCR法を行った。回収したEBはRT-PCR法でPax2遺伝子が発現していることが確認できた。また他の腎発生の各段階で発現 して くる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認したところ、aquaporin-1、Integrin a8、BMP4、BMP7、Pax8、Podocinの発現上昇が認められた。そこ で、これらのEBをPax2発現細胞に対し、Pax2で標識した細胞を回収する条件でFACSを行い、細胞回収を行った。これらの細胞に対し、再度上記の遺伝子の発現が 上昇しているかをRT-PCR法で確認したところ、aquaporin-1の上昇が確認できた。今後他の培養条件を試し、違う性質の細胞が回収できるかを繰り返しながら、こ標的の細胞への分化が起こっているかの確認を継続する。