マーモセットを用いた緑内障関連遺伝子の病態解明

動物実験中央研究所にてマーモセットの取り扱い研修ならびに解析に必要なマーモセット眼球を採取した。また、動物実験中央研究所から譲渡されたマーモセットES細胞の培養を開始した。緑内障関連遺伝子の表現型評価のため、ヒトiPS細胞を用いた報告 (Sluch et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017)を参考に、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術によりマーモセットES細胞から網膜神経節細胞マーカーであるPOU4F2遺伝子の下流にEGFPレポーターを組み込んだ細胞を樹立した。今後、網膜神経節細胞への分化誘導ならびにMACS精製により網膜神経節細胞を単利し、非ヒト霊長類の網膜神経節細胞ならびに視神経の解析に用いる予定である。また、マーモセットES細胞から神経前駆細胞およびアストロサイトの分化誘導を試みた。加えて、患者診察に用いる機器と同機種の光干渉断層計（OCT）を用い、申請者が所属する施設に導入されたマーモセット個体の眼底写真ならびに網膜断層撮影が可能であることを確認した。加えて、アデノ随伴ウイルス の一種であるAAV2に蛍光レポータータンパク質を搭載させたベクターを硝子体内投与したのち、２か月後に眼球を摘出して網膜進展標本を作製し蛍光顕微鏡で観察した。その結果、網膜神経節細胞が蛍光ラベルされており、網膜神経節細胞の細胞体ならびに軸索が顕微鏡下で可能であることを確認した。参考文献Sluch, V.M., Chamling, X., Liu, M.M., Berlinicke, C.A., Cheng, J., Mitchell, K.L., Welsbie, D.S., and Zack, D.J. (2017). Enhanced Stem Cell Differentiation and Immunopurification of Genome Engineered Human Retinal Ganglion Cells. Stem Cells Transl. Med.

動物実験中央研究所にてマーモセットの取り扱い研修ならびに解析に必要なマーモセット眼球を採取した。また、動物実験中央研究所から譲渡されたマーモセットES細胞の培養を開始した。緑内障関連遺伝子の表現型評価のため、ヒトiPS細胞を用いた報告 (Sluch et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017)を参考に、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術によりマーモセットES細胞から網膜神経節細胞マーカーであるPOU4F2遺伝子の下流にEGFPレポーターを組み込んだ細胞を樹立した。今後、網膜神経節細胞への分化誘導ならびにMACS精製により網膜神経節細胞を単利し、非ヒト霊長類の網膜神経節細胞ならびに視神経の解析に用いる予定である。また、マーモセットES細胞から神経前駆細胞およびアストロサイトの分化誘導を試みた。加えて、患者診察に用いる機器と同機種の光干渉断層計（OCT）を用い、申請者が所属する施設に導入されたマーモセット個体の眼底写真ならびに網膜断層撮影が可能であることを確認した。加えて、アデノ随伴ウイルス の一種であるAAV2に蛍光レポータータンパク質を搭載させたベクターを硝子体内投与したのち、２か月後に眼球を摘出して網膜進展標本を作製し蛍光顕微鏡で観察した。その結果、網膜神経節細胞が蛍光ラベルされており、網膜神経節細胞の細胞体ならびに軸索が顕微鏡下で可能であることを確認した。参考文献Sluch, V.M., Chamling, X., Liu, M.M., Berlinicke, C.A., Cheng, J., Mitchell, K.L., Welsbie, D.S., and Zack, D.J. (2017). Enhanced Stem Cell Differentiation and Immunopurification of Genome Engineered Human Retinal Ganglion Cells. Stem Cells Transl. Med.