Zeitaufgelöstes Fluoreszenzimaging zum selektiven Nachweis von NAD(P)H- bzw. FAD-abhängigen Enzymen am Beispiel zellvermittelter Pathogenzerstörung

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Im Rahmen dieses Projektes sollen die Machbarkeit und die Vorteile eines intrazellulären selektiven Enzymnachweises mittels markerfreier zeitaufgelöster fluoreszenzmikroskopischer Methoden (mono- und biexponentielles FLIM und FAIM, d.h. Fluoreszenzlebensdauer bzw. Fluoreszenzanisotropie Imaging) erforscht werden, die die Coenzyme NADH, NAD(P)H und FAD als endogene Signalvermittler benutzen. Hierfür werden Experimente an NADH, NADPH und FAD abhängigen Enzymen sowohl unter extra- als auch unter intrazellulären Bedingungen durchgeführt. Dieses Vorhaben ist von allgemeiner Relevanz für die Biowissenschaften, da der intrazelluläre Enzymnachweis mit einer direkten hoch aufgelösten Erfassung vitaler von den entsprechenden Enzymen katalysierter Prozesse gleichzusetzen ist. Als konkretes Beispiel mit besonderer biowissenschaftlicher Bedeutung wurde die NADPH Oxidase ausgewählt, ein NADPH abhängiges Enzym, das eine zentrale Rolle in der zellvermittelten Pathogenzerstörung sowohl in pflanzlichen (Nicotiana tabacum) als auch in tierischen Zellen (neutrophilen Granulozyten) hat. Mit Hilfe der vorgeschlagenen Methoden (FLIM und FAIM) sollen erstmalig die Kinetik und die Lokalisierung der Aktivierung der NADPH Oxidase intrazellulär aufgeklärt werden. Die Untersuchungen sollen sich nicht nur auf in vitro Experimente beschränken sondern auch in Gewebe und sogar im lebenden Organ durchgeführt werden, wofür die Zweiphotonen-Mikroskopie zum Einsatz kommt. Ein Vergleich der Aktivierung der NADPH Oxidase in pflanzlichen Zellen gegenüber tierischen Zellen ist abschließend geplant.