血圧調節に関わる小胞体イオンチャネルTRICの作動機構の解明と制御

小胞体からのCa2+放出は、筋収縮、神経伝達をはじめとして多様な生命現象と関わっている。その一方で、小胞体膜上のCa2+チャネルの開口によるCa2+放出は小胞体内腔側における負電荷の発生につながるため、効率的なCa2+放出を維持すべく、その負電荷を打ち消すための分子機構が存在するのではないかと長年考えられていた。TRICはこの分子機構に関わる小胞体チャネルであり、高血圧症との関連が指摘されている。本研究では、TRICチャネルの構造、機能解析を通して、TRICの作動機構および制御機構の解明を試みた。構造解析に向けた安定な発現系同定のため、真核生物由来および原核生物由来のTRICについてGFP蛍光を指標としたゲル濾過クロマトグラフィー法であるGFP-FSEC法による網羅的発現スクリーニングを行った。その結果、特に原核生物由来のTRIC3種について、高い結晶化能を持つことを示唆する、鋭い単分散性のゲル濾過クロマトグラフィーピークを示すことを見出した。さらに、膜タンパク質熱安定性評価法であるFSEC-TS法により、これらTRICについて高温度下でも安定であることを確認した。一般にタンパク質の熱安定性とその結晶化能は高い相関性があるため、これらのTRICについても極めて高い結晶化能が見込まれる。その後、同定されたTRICの精製試料調製に成功し、結晶化スクリーニングへと進めた。最終的に得られた構造解析に適した結晶を用いて、大型放射光施設にて回折データの収集を行い、さらに、TRICのセレノメチオニン置換体結晶を作成し、回折データを測定することで、多波長異常分散法による位相決定を行った。最終的に２種のTRICチャネルについてそれぞれ構造決定に成功した。

小胞体からのCa2+放出は、筋収縮、神経伝達をはじめとして多様な生命現象と関わっている。その一方で、小胞体膜上のCa2+チャネルの開口によるCa2+放出は小胞体内腔側における負電荷の発生につながるため、効率的なCa2+放出を維持すべく、その負電荷を打ち消すための分子機構が存在するのではないかと長年考えられていた。TRICはこの分子機構に関わる小胞体チャネルであり、高血圧症との関連が指摘されている。本研究では、TRICチャネルの構造、機能解析を通して、TRICの作動機構および制御機構の解明を試みた。構造解析に向けた安定な発現系同定のため、真核生物由来および原核生物由来のTRICについてGFP蛍光を指標としたゲル濾過クロマトグラフィー法であるGFP-FSEC法による網羅的発現スクリーニングを行った。その結果、特に原核生物由来のTRIC3種について、高い結晶化能を持つことを示唆する、鋭い単分散性のゲル濾過クロマトグラフィーピークを示すことを見出した。さらに、膜タンパク質熱安定性評価法であるFSEC-TS法により、これらTRICについて高温度下でも安定であることを確認した。一般にタンパク質の熱安定性とその結晶化能は高い相関性があるため、これらのTRICについても極めて高い結晶化能が見込まれる。その後、同定されたTRICの精製試料調製に成功し、結晶化スクリーニングへと進めた。最終的に得られた構造解析に適した結晶を用いて、大型放射光施設にて回折データの収集を行い、さらに、TRICのセレノメチオニン置換体結晶を作成し、回折データを測定することで、多波長異常分散法による位相決定を行った。最終的に２種のTRICチャネルについてそれぞれ構造決定に成功した。