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時間分割X線結晶構造解析による鉄硫黄クラスター生合成酵素の触媒反応機構の解明

通过时间分辨X射线晶体结构分析阐明铁硫簇生物合成酶的催化反应机制

基本信息

批准号：
22KJ0453
负责人：
國近航平
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Saitama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0453/
关键词：
鉄硫黄クラスター生合成 X線結晶構造解析

项目摘要

鉄硫黄（Fe-S）クラスターは多彩な生体反応を触媒する無機補因子であり、主に[2Fe-2S]や[4Fe-4S]の形状でタンパク質と結合している。Fe-Sクラスター生合成酵素IscUは、[2Fe-2S]を[4Fe-4S]へと還元的に変換する「クラスター変換反応」を触媒するが、その詳細な触媒反応機構は不明である。申請者はすでにクラスター変換反応の前駆体である[2Fe-2S]結合型IscUのX線結晶構造解析に成功しており、本研究では、この系を利用して反応中間体の解析を行い、その反応機構を調べる。本年度は、結晶内クラスター変換反応に向けたIscUの精製・結晶化条件の最適化、および変異型IscUを用いた反応中間体の補足を試みた。IscU結晶内でクラスター変換反応を進行させて反応中間体のX線結晶構造を正確に決定するためには、高分解能での構造解析が必要となる。そこで高分解能X線結晶構造解析が可能となる良質なIscU結晶の作成に向けて、IscUの精製・結晶化の条件検討を行った。これまでに複数の条件で結晶が得られているが、高分解能構造解析が可能な結晶は得られていない。また、IscUの活性部位に様々なアミノ酸点変異を導入し、反応中間体または生成物[4Fe-4S]を安定に結合した状態で精製できる変異型IscUの作成を試みた。種々の変異型IscUを発現、精製し、分光学的解析を行うと、そのうち二種類の変異型IscUにおいて、溶液中で反応中間体または[4Fe-4S]結合型IscUが部分的に含まれている可能性が見出された。

Iron sulfur (Fe-S) can be used as a catalyst for organic reactions. The main form of iron sulfur is [2Fe-2S] or [4Fe-4S]. Fe-S crasogenic enzyme IscU,[2Fe-2S],[4Fe-4S], and catalytic reaction mechanism are unknown. The applicant has successfully analyzed the X-ray crystal structure of [2Fe-2S]-bound IscU by using the reaction intermediate and adjusting the reaction mechanism. This year, the optimization of purification and crystallization conditions for IscU and the completion of intermediate for IscU were studied. The X-ray crystal structure of the intermediate is determined correctly, and the structural analysis of the high decomposition energy is necessary. High resolution energy X-ray crystal structure analysis is possible to improve the quality of IscU crystal production direction, IscU purification and crystallization conditions are discussed. This is a complex condition for crystallization, high decomposition energy structure analysis, and crystallization. The active site of IscU was introduced into the reaction medium and the product [4Fe-4S] was purified. The possibility of discovery, purification and spectroscopic analysis of two kinds of heterotypic IscU in solution and partial inclusion of [4Fe-4S]-bound IscU in solution has been shown.