金被覆ミクロキャピラリーLC装着質量分析による癌特異ペプチドの超高感度構造決定

使用金包被微毛细管 LC 质谱法超灵敏测定癌症特异性肽的结构

• 批准号: 08877356
• 负责人: 中西 豊文
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Osaka Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877356/
• 关键词: エレクトロスプレーイオン化質量分析法; ナノスプレー手法; 異常Hb症; 神経変性疾患; アダクト分子; 固定化酵素; エレクトロスプレーイオン化質量分析; 免疫沈降物; 銅; 亜鉛-SOD; 変異型; 正常型比; 新規変異種; 超高感度分析; 自家製ミクロキャピラリーカラム; ナノLC; アミノ酸配列; 完全分子

異常ヘモグロビン症、家族性筋萎縮性側索硬化症、家族性アミロイドポリニューロパチーなどの疾患は体液中に存在する疾患関連蛋白質(ヘモグロビン:Hb、銅/亜鉛スーパーオキサイドジスムターゼ、トランスサイレチン:TTR)の構造異常が起因する。それら構造変異蛋白を検出し同定することにより確定診断できる。昨年に引き続き、自家製ナノスプレーチップを連結させたエレクトロスプレーイオン化質量分析法を用い、更に固定化酵素を用いた微量サンプルでしかも迅速に検出・同定し得る分析システムを確立し、学内外よりの依頼分析を実施している。今回、新しく固定化酵素を用いて変異蛋白の同定を実施したが、この手法は、より微量蛋白質の構造解析にも応用可能と思われた。今年度は、異常Hb:5種類、変異TTR:3種類の変異を検出・同定した。それ以外に、新しい種々の翻訳後修飾分子を検出した。それら分子は、重要な代謝過程に関連している可能性もある。翻訳後修飾蛋白質の構造解析:1)Hb:高分解能HPLCにて患者溶血サンプルを分取し、各分画をLC/ESIMSにて分析し、ホルミル化Hb(+28Da)及びC末端アミノ酸脱離Hb(desarginine:-156Da)を検出した。このような、修飾Hbは今までに報告例はない。2)TTR:健常者血清あるいは標品TTRを分析すると、正常遊離TTR分子以外に、種々のジスルフィド結合分子(システイン、システイニルグリシン及びグルタチオン)が検出されることを報告してきた。それ以外に、80Da大きいTTR分子及び46Da小さいTTR分子がそれぞれ検出された。+80DaTTR分子は、リン酸化TTRであるという報告があるが、DTT還元後、完全に消失してしまうことより、リン酸化分子とは考えにくく、ジスルフィド化合物と推察された。そこで、モリブデン補因子欠損(先天性サルファイト酸化酵素欠損)症候群乳児の血清を夕ンデムLC-LC/ESIMS法にてTTR分子を分離・分析し、その分子量転換スペクトルを解析すると、正常TTR分子(13758.4±1.0Da)以外に+80DaシフトしたTTRアダクト(13838.9±1.1Da).を検出した。この結果は、+80Daがサルファイト分子であるとする我々の結論を支持する重要な結果と考えている。また、上記方法にてTTR分子を精製し、ギ酸変性後、酵素消化し、MSMS分析し、そのCIDスペクトルより10番目Cys→Glyを同定した(プロテインシークエンサーにても確認)。-46DaTTR分子に関しては、これまでに報告はなくCys側鎖がInvivoで切断され、Glyに変化したものであると推察した。今回得られた結果は、第46回米国質量分析学会(Orland,FL)その他国内外の学会で発表し、高い評価を受けた。

The structural abnormality causes of disease-related proteins (Hb, Cu/Pb) present in body fluids of abnormal diseases such as amyotrophic lateral sclerosis, familial amyotrophic lateral sclerosis and familial amyotrophic lateral sclerosis. The structure of the protein is different from that of the protein. In the past year, the quality analysis method for the preparation of self-made enzymes has been used, and the immobilized enzymes have been used in the micro-analysis method. The rapid detection, identification and analysis methods have been established, and the internal and external analysis has been carried out. Now, new immobilized enzymes are used to determine the identity of different proteins, and new methods are used to analyze the structure of microproteins. This year, abnormal Hb:5 kinds, different TTR:3 kinds, different TTR:3 kinds, different TTR: 5 kinds, different TTR: 5 kinds, different TTR A new type of DNA is found in the genome. The possibility of molecular association with important metabolic processes Structural analysis of post-translational modified proteins:1)Hb: High resolution energy HPLC analysis of hemolytic proteins from patients, LC/ESIMS analysis of each component, detection of Hb(+28Da) and Hb(desargine:-156Da) from C-terminal amino acids. This is the first time I've ever been to a hospital. 2)TTR: Normal serum samples are analyzed for TTR, normal free TTR molecules, species and binding molecules (such as those in the serum and those in the serum). 80Da TTR molecules and 46Da TTR molecules are included in the list. 80DaTTR molecules are reported to disappear completely after DTT is restored. TTR molecule was isolated and analyzed by LC-LC/ESIMS in serum from infants with congenital deficiency of complement factor (congenital deficiency of acidifying enzyme) syndrome. The molecular weight of TTR molecule was analyzed by +80 Da except for normal TTR molecule (13758.4± 1.0 Da). The first time I checked out. This result supports the conclusion that the +80 Da molecule is important. The method described above includes purification of TTR molecules, enzyme digestion, MSMS analysis, CID selection, 10-point Cys→Gly identification. 46DaTTR molecules are closed, closed, closed The results of this review were reviewed by the 46th National Institute for Quality Analysis (Orland,FL) and other national and international organizations.

项目成果

Nakanishi T, Miyazaki A, Kishikawa M, Shimizu A, Aoki & Kikuchi M.: "Hb Sagami〔β139(H17)Asn->Thr〕,a new variant hemoglobin,not detected by isoelectrofocusing and isopropanol test,but detected by electrospray ionization mass spectrometry." J.Mass Spectrom.

Nakanishi T, Miyazaki A, Kishikawa M., Shimizu A, Aoki & Kikuchi M.：“Hb Sagami〔β139(H17)Asn->Thr〕，一种新的变异血红蛋白，未通过等电聚焦和异丙醇测试检测到，但通过电喷雾电离检测到质谱法。”J.质谱法。

Kishikawa M,Nakanishi T,Miyazaki A,Shimizu A,et.al.: "Rapid detection of abnormal transthyretin from patients with familial amyloidotic polyneuropathy by HPLC/ESI-MS using material precipitated with specific antiserum." J. Mass Spectrom.31(1). 112-114 (19

Kishikawa M、Nakanishi T、Miyazaki A、Shimizu A 等人：“使用特异性抗血清沉淀的材料，通过 HPLC/ESI-MS 快速检测家族性淀粉样多发性神经病患者的异常转甲状腺素蛋白。”

Nakanishi T, Miyazaki A, Kishikawa M, Shimizu A & Aoki Y.: "Hb Peterborough [β111(GH13)Val→Phe],in a Japanese female,rapid identification by ESl/MS/MS using proteolytic digests of oxidized globin" Hemoglobin.22・1. 23-35 (1998)

Nakanishi T、Miyazaki A、Kishikawa M、Shimizu A 和 Aoki Y.：“Hb Peterborough [β111(GH13)Val→Phe]，在日本女性中，使用氧化球蛋白的蛋白水解消化通过 ESl/MS/MS 快速识别”血红蛋白.22・1.23-35 (1998)

A.Miyazaki.Nakanishi T, Kishikawa M, Nakagawa T, Shimizu A, Mawjood AHM, Imai K, Aoki Y & Kikuchi M.: "Compound heterozygosity for b+-thalassemia-31(A->G) and a variant with low oxygan affinity,Hb Sagami [b139(H17)Asn->Thr]." Hemoglobin in press.

A.宫崎.中西T，岸川M，中川T，清水A，Mawjood AHM，今井K，青木Y

Nakanishi T,Miyazaki A,Kishikawa M,Shimizu A,et. al.: "ESI-MS/MS analysis of peptides derived by enzymatic digestion of oxidized globin chain,an improved method to detect substitution in the hemoglobin "core"." J. Am. Soc. Mass Spectrom.7(10). 1040-1049 (

中西 T、宫崎 A、岸川 M、清水 A 等。