Creation of trait diversity through gene dosage effects in allopolyploid wheat

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2022年度はゲノム編集により、開花時期に関する３つの遺伝子をノックアウトした系統を得ることを目的にした。標的遺伝子について、同祖遺伝子を全て含め特異的に認識する gRNA を WheatCripsr (Cram et al. 2019) を用いて１遺伝子につき２つ作製し、Hahn et al. (2019) の tRNA-gRNA 同時発現系により、計６つの gRNA を同時に発現するゲノム編集用ベクターを構築した。ゲノム編集の可否を判断するため、作製したベクターをアグロバクテリウム法により四倍体コムギ品種 "Kronos" へ導入し、その選抜カルスから DNA を抽出した結果、標的遺伝子の１つである PHYTOCLOCK1(PCL1) でゲノム編集が確認された。そして、カルスから計 61 の再分化個体（ T0 植物）を得た。しかしながら、標的遺伝子がゲノム編集された再分化個体は検出されなかった。そこで、Cas9 遺伝子を Hahn et al. (2019) による切断効率のより高い Cas9 遺伝子へと変更した。加えて、複数の gRNA 設計サイトを併用して１遺伝子につき６つの gRNA を設計した。また、Abe et al. (2019) による　Qsd1 の gRNA を用いることで、四倍体コムギにおいて tRNA-gRNA システムにより複数の gRNA を同時に発現できることを確認した。変更後 Cas9 遺伝子ならびに再設計した６つの gRNA を導入した "Kronos" の選抜カルスでは、実施当初に比較して高頻度で目的遺伝子のゲノム編集が確認できた。