光遺伝学によるp53を介した細胞応答決定機構の構成的理解

利用光遗传学对 p53 介导的细胞反应决定机制的构成性理解

• 批准号: 21J15111
• 负责人: 鶴岡 樹
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: The Graduate University for Advanced Studies
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-28 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21J15111/
• 关键词: p53; シグナル伝達; 光遺伝学; イメージング; 転写因子

本年度は、光遺伝学を用いたp53活性制御系の構築と細胞応答操作への応用に取り組んだ。1. 光誘導二量体化システムを用いたp53活性制御系p53の転写活性化ドメイン（TAD）をDNA結合ドメイン（DBD）へ光依存的にリクルートすることでp53の転写活性を調節可能なシステム（Opto-p53）の開発を行った。光遺伝学ツールとして、青色光照射により可逆的に二量体化するCRY2-CIBN系を用いた。p53転写レポーター発現細胞に対してp53TAD-CRY2とCIBN-p53DBDを各々導入し、光照射したところ、2つのフラグメントが共発現する細胞でのみp53の転写活性化が観察された。また、これらの細胞では有意に細胞増殖が抑制され、一部の細胞は細胞死を引き起こした。2. 光誘導解離システムを用いたp53活性制御系上記のシステムに加え、異なるコンセプトによるp53活性制御系開発を試みた。p53とその負の制御因子であるMDM2/MDMXの相互作用を阻害する短いペプチド配列（PMI）を光依存的に核移行させることで、p53の活性を制御するシステム（Opto-MDM2i）を開発した。光遺伝学ツールとして、青色光照射により目的のフラグメントをミトコンドリア膜上から可逆的に解離可能なLOVTRAPを用いた。蛍光タグ付きp53発現細胞に対してOpto-MDM2iを発現させ、光照射したところ、p53の発現上昇が見られた。p53-MDM2/MDMX相互作用を阻害できない変異体（PMI-NC）ではこの変化が見られなかったため、p53の発現上昇はPMIペプチドの核移行により引き起こされていることが示された。また、p53転写レポーター発現細胞に対してOpto-MDM2iを発現させ、光照射したところ、PMIペプチドの条件でのみp53の転写活性化が観察された。さらに、これらの細胞では有意に細胞増殖が抑制されていた。

今年，我们使用光遗传学和应用于细胞反应操作的应用来构建p53活性控制系统。 1。我们开发了一个系统（Opto-P53），该系统可以通过使用光诱导的二聚化系统以光依赖性方式募集p53活性控制系统的转录激活域（TAD）来调节p53的转录活性。作为一种光遗传学工具，使用了Cry2-CIBN系统，该系统使用蓝光照射可逆地二聚体。当将p53tad-cry2和ciBn-p53dbd引入表达p53转录报告基因的细胞中，并用光照射，仅在共表达两个片段的细胞中观察到p53的转录激活。此外，这些细胞中细胞增殖受到显着抑制，一些细胞导致细胞死亡。 2。P53活动控制系统，使用光诱导的解离系统除了上述系统外，我们还尝试使用不同概念开发p53活动控制系统。我们开发了一种系统（Opto-MDM2I），该系统通过以光依赖性方式核转移来调节p53（Opto-MDM2I）的活性，通过核转移短肽序列（PMI）抑制p53与其负调控因子MDM2/MDMX之间的相互作用。作为一种光遗传学工具，使用了Lovtrap，它允许使用蓝光的照射从线粒体膜中可逆地分离感兴趣的片段。 Opto-MDM2I在荧光标记的表达P53细胞上表达，并且当辐照光Opo-MDM2I时，观察到p53的表达增加。在无法抑制p53-MDM2/MDMX相互作用（PMI-NC）的突变体中没有看到这种变化，表明p53的表达升高是由PMI肽的核转运引起的。此外，当在表达p53转录报告基因并用光照射的细胞上表达Opto-MDM2I时，仅在PMI肽的条件下才观察到p53的转录激活。此外，这些细胞中细胞增殖受到显着抑制。

项目成果

Development of a fluorescence reporter system to quantify transcriptional activity of endogenous p53 in living cells

• DOI: 10.1101/2022.08.03.502578
• 发表时间: 2022-12
• 期刊: bioRxiv
• 作者: Tatsuki Tsuruoka;Emiri Nakayama;T. Endo;Shingo Harashima;Rui Kamada;K. Sakaguchi;T. Imagawa

Optogenetic control of p53 signaling pathway

p53信号通路的光遗传学控制

• 发表时间: 2023
• 作者: Tatsuki Tsuruoka;Yuhei Goto;Kazuhiro Aoki
• 通讯作者: Kazuhiro Aoki

光遺伝学を用いたp53シグナル伝達経路の操作法開発

开发利用光遗传学操纵 p53 信号通路的方法

• 发表时间: 2023
• 作者: 鶴岡 樹;後藤 祐平;青木 一洋
• 通讯作者: 青木 一洋