新規神経ペプチド(HCNP)受容体の同定と単離および構造改正

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1.Radiolabeled receptor assey(RRA)系の確立ラット脳組織と氷冷0.32Mショ糖溶液中でホモジェナイズ後、遠心法でP1(核画分)、P2(mitochondria-synaptosome画分)、P3(microsome画分)及び可溶性画分に分離した。ラットHCNPをBolton-Hunter法でヨード化し、0.3%BSAを含むRRA溶液(50mM Tris-HCL,pH7.6)で希釈して標識リガンド(^<125>I-HCNP)とした。200μlの画分に0.342MBqの^<125>I-HCNPを50μl、RRA溶液または非標識リガンド溶液(50μl)を加え300μlとし、30℃で30分インキューベーションした。氷冷RRA溶液1mlを加えWhatman GF/Fフィルターを用い非結合を除去し、標識リガンドの結合が非標識リガンド(1nmol/assy)で置換された結合を特異的結合とした。可溶性成分のRRAは反応後、30%の氷冷PEG600を加え遠心法で非結合リガンドを除去して測定した。2.HCNP受容体の性質^<125>I-HCNPの結合成分は、(1)P1画分に9.0%、P2画分に74.9%、P3画分に14.9%、可溶性画分に1.2%分画され、(2)大脳皮質に多く、小脳や線条体には少ない。また、(3)^<125>I-HCNPの受容体への結合は濃度依存性に増加し50nM近傍で飽和した。(Bmaxは9.4nM/mg,Kdは3.53×10^<-11>M)。(4)HCNP受容体は高親和性の単一受容体である。(5)^<125>I-HCNPはそのC末端近傍が受容体への結合する。(6)HCNP受容体はCHAPSで可溶化される。3.HCNP受容体精製における問題点とその解決法(1)HCNP受容体は不安定で凍結下でも長期保存が困難。(2)上記RRA系のBacl groundを低下し、assay系を縮小し使用蛋白量を減量するのに、標識リガンドの純度を上げることやGF/Fフィルターを0.3%免疫グロブリンで前処置することが効果的であった。