新規神経ペプチド(HCNP)受容体の同定と単離および構造改正

新型神经肽（HCNP）受体的鉴定、分离和结构修饰

• 批准号: 09680769
• 负责人: 小鹿 幸生
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09680769/
• 关键词: 神経ペプチド; HCNP; 海馬由来神経刺激因子; HCNP受容体; Radiolabeled Receptor Assay; コリン作動性神経; 中枢神経; 受容体; 海部由来神経刺激因子; RRA; 中枢神経系; Kd; 活性中心

1.Radiolabeled receptor assey(RRA)系の確立ラット脳組織と氷冷0.32Mショ糖溶液中でホモジェナイズ後、遠心法でP1(核画分)、P2(mitochondria-synaptosome画分)、P3(microsome画分)及び可溶性画分に分離した。ラットHCNPをBolton-Hunter法でヨード化し、0.3%BSAを含むRRA溶液(50mM Tris-HCL,pH7.6)で希釈して標識リガンド(^<125>I-HCNP)とした。200μlの画分に0.342MBqの^<125>I-HCNPを50μl、RRA溶液または非標識リガンド溶液(50μl)を加え300μlとし、30℃で30分インキューベーションした。氷冷RRA溶液1mlを加えWhatman GF/Fフィルターを用い非結合を除去し、標識リガンドの結合が非標識リガンド(1nmol/assy)で置換された結合を特異的結合とした。可溶性成分のRRAは反応後、30%の氷冷PEG600を加え遠心法で非結合リガンドを除去して測定した。2.HCNP受容体の性質^<125>I-HCNPの結合成分は、(1)P1画分に9.0%、P2画分に74.9%、P3画分に14.9%、可溶性画分に1.2%分画され、(2)大脳皮質に多く、小脳や線条体には少ない。また、(3)^<125>I-HCNPの受容体への結合は濃度依存性に増加し50nM近傍で飽和した。(Bmaxは9.4nM/mg,Kdは3.53×10^<-11>M)。(4)HCNP受容体は高親和性の単一受容体である。(5)^<125>I-HCNPはそのC末端近傍が受容体への結合する。(6)HCNP受容体はCHAPSで可溶化される。3.HCNP受容体精製における問題点とその解決法(1)HCNP受容体は不安定で凍結下でも長期保存が困難。(2)上記RRA系のBacl groundを低下し、assay系を縮小し使用蛋白量を減量するのに、標識リガンドの純度を上げることやGF/Fフィルターを0.3%免疫グロブリンで前処置することが効果的であった。

1. Radiolabeled receptor asset (RRA) was isolated from established tissue, mitochondria-synaptosome, microsomal and soluble fractions by centrifugation in 0.32M glucose solution. The Bolton-Hunter method for HCNP was developed using 0.3% BSA in a solution containing RRA (50mM Tris-HCL,pH 7.6)<125>. 200μ l <125>of RRA solution and 50 μ l of non-labeled RCNP solution were added at 30℃ for 30 minutes. Cold RRA solution 1ml Add Whatman GF/F to the solution without binding, remove the label from the solution without binding (1nmol/assy), replace the binding with specific binding. Soluble components of RRA were determined after 30% of PEG600 was added to the remote center without binding. 2. Properties of HCNP receptor ^<125>I-HCNP binding components are: (1)P1 9.0%, P2 74.9%, P3 14.9%, soluble 1.2%,(2) large cortex more, small cortex less than. (3) The binding of <125>I-HCNP receptor increased concentration-dependently to 50nM near saturation. (Bmaxは9.4nM/mg,Kdは3.53×10^<-11>M)。(4) The HCNP receptor is a single receptor with high affinity. (5)^<125>I-HCNP binding to receptor near C-terminal. (6)HCNP receptor is soluble in CHAPS. 3. The solution to the problem of HCNP receptor purification (1) The HCNP receptor is unstable and difficult to preserve for a long time under freezing. (2)Note that the RRA system's Bacl ground is low, the assay system is reduced, the amount of protein used is reduced, the purity of the label is increased, and the GF/F ratio is 0.3%.

项目成果

Kosei Ojika: "Hippocampal cholinergic neurostimulating peptide(HCNP)"Prog. Neurobiol.. 60(1). 37-83 (2000)

Kosei Ojika：“海马胆碱能神经刺激肽（HCNP）”Prog。