タイトジャンクション可逆的開口剤の作用機構の解明と薬剤吸収促進剤への応用

シュードモナス由来の天然環状ペプチドMA026はイヌ腎臓上皮細胞MDCK IIで上皮細胞間接着構造であるタイトジャンクションを開口する活性を示すことが報告されており、経皮吸収促進剤の候補として注目されている。以前の研究より、MA026はタイトジャンクションの重要な構成タンパク質であるClaudin-1のVFDSLL領域へ結合することが示唆されているが、結合様式の詳細や結合後にタイトジャンクション開口を引き起こすメカニズムは不明のままである。本研究ではMA026のタイトジャンクション開口メカニズムの詳細な分子機構の解析を目的とする。MDCK IIで発現している5種類のClaudinを全てノックアウト(KO)したタイトジャンクション構造を持たないqKO細胞株に各ClaudinファミリーまたはVFDSLL領域に変異を入れたClaudin-1を発現させた株を取得し、それらの細胞株に対して物質透過性実験を行うことでMA026とClaudinの相互作用を明らかにすることを目指す。今回、qKO細胞へ発現させるClaudinへ付加するタグを検討したところ、N末端側にMycタグを付加したClaudin-1が十分なタイトジャンクション形成能を示し、解析に適していることが明らかとなった。さらに今回取得したN末端Myc-Claudin-1発現細胞株では、MA026処理によるタイトジャンクション開口活性も確認できた。また、N末端にMycタグを付加した他のClaudinファミリーの発現プラスミドの構築を複数完了した。

シュードモナス由来の天然環状ペプチドMA026はイヌ腎臓上皮細胞MDCK IIで上皮細胞間接着構造であるタイトジャンクションを開口する活性を示すことが報告されており、経皮吸収促進剤の候補として注目されている。以前の研究より、MA026はタイトジャンクションの重要な構成タンパク質であるClaudin-1のVFDSLL領域へ結合することが示唆されているが、結合様式の詳細や結合後にタイトジャンクション開口を引き起こすメカニズムは不明のままである。本研究ではMA026のタイトジャンクション開口メカニズムの詳細な分子機構の解析を目的とする。MDCK IIで発現している5種類のClaudinを全てノックアウト(KO)したタイトジャンクション構造を持たないqKO細胞株に各ClaudinファミリーまたはVFDSLL領域に変異を入れたClaudin-1を発現させた株を取得し、それらの細胞株に対して物質透過性実験を行うことでMA026とClaudinの相互作用を明らかにすることを目指す。今回、qKO細胞へ発現させるClaudinへ付加するタグを検討したところ、N末端側にMycタグを付加したClaudin-1が十分なタイトジャンクション形成能を示し、解析に適していることが明らかとなった。さらに今回取得したN末端Myc-Claudin-1発現細胞株では、MA026処理によるタイトジャンクション開口活性も確認できた。また、N末端にMycタグを付加した他のClaudinファミリーの発現プラスミドの構築を複数完了した。