細胞内水の状態観測による凍結保存メカニズムの再検討

細胞の凍結保存は半世紀以上前に開発され、畜・水産業等で実用化されている技術である。そのメカニズムは「細胞外水の凍結による細胞からの脱水と細胞内水のガラス化」であるとされている。しかし神経細胞など高需要でも凍結保存できていない細胞種があり、細胞内水のガラス化も実験的に証明されていない。そこで本研究は凍結保存メカニズムを実験的に再検討するため、天然の凍結保護剤（CPA)であるトレハロースを用い、トレハロース輸送タンパク質を発現させた細胞と、透水性を向上させた細胞の2種類のユニークな細胞系を使って、凍結過程における細胞内水の状態を変えた実験を行う。そして細胞を顕微鏡観察しながら水の状態を3種類の分光（Raman、近赤外、誘電）測定で観測し、細胞からの脱水過程の評価と、細胞内水の状態評価とを行うことを目標としている。令和4年度は、まず分光測定をする際に細胞内外の状態を区別して計測できるようにするため、接着状態の細胞を凍結保存する技術を開発した。実験で使用する2種類の細胞系について、トレハロースや既存のCPAであるDMSO等を使った実験を行い、緩慢凍結法で接着細胞の凍結保存が可能かを調べた。一方各分光学的手法に関して、細胞を含まない凍結液を3種の手法で測定し、各測定法の確認と細胞のバックグラウンドとなる凍結液の基盤スペクトル等を収集した。特にCPAとして用いたトレハロースと水溶液との相互作用について、各分光学的手法から得られる情報を集約した。なお本年度は「顕微Raman分光測定用試料温調装置」を導入したが、半導体不足等による物資調達困難な状況が生じ、納期が予定より大幅に遅延した。そのため、上記分光学的測定は室温で実施した。

細胞の凍結保存は半世紀以上前に開発され、畜・水産業等で実用化されている技術である。そのメカニズムは「細胞外水の凍結による細胞からの脱水と細胞内水のガラス化」であるとされている。しかし神経細胞など高需要でも凍結保存できていない細胞種があり、細胞内水のガラス化も実験的に証明されていない。そこで本研究は凍結保存メカニズムを実験的に再検討するため、天然の凍結保護剤（CPA)であるトレハロースを用い、トレハロース輸送タンパク質を発現させた細胞と、透水性を向上させた細胞の2種類のユニークな細胞系を使って、凍結過程における細胞内水の状態を変えた実験を行う。そして細胞を顕微鏡観察しながら水の状態を3種類の分光（Raman、近赤外、誘電）測定で観測し、細胞からの脱水過程の評価と、細胞内水の状態評価とを行うことを目標としている。令和4年度は、まず分光測定をする際に細胞内外の状態を区別して計測できるようにするため、接着状態の細胞を凍結保存する技術を開発した。実験で使用する2種類の細胞系について、トレハロースや既存のCPAであるDMSO等を使った実験を行い、緩慢凍結法で接着細胞の凍結保存が可能かを調べた。一方各分光学的手法に関して、細胞を含まない凍結液を3種の手法で測定し、各測定法の確認と細胞のバックグラウンドとなる凍結液の基盤スペクトル等を収集した。特にCPAとして用いたトレハロースと水溶液との相互作用について、各分光学的手法から得られる情報を集約した。なお本年度は「顕微Raman分光測定用試料温調装置」を導入したが、半導体不足等による物資調達困難な状況が生じ、納期が予定より大幅に遅延した。そのため、上記分光学的測定は室温で実施した。