細胞内水の状態観測による凍結保存メカニズムの再検討

通过观察细胞内水的状态重新审视冷冻保存机制

• 批准号: 22K18678
• 负责人: 内田 努
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K18678/
• 关键词: 接着細胞; 凍結保存; トレハロース; ラマン測定; 近赤外分光; 誘電分光; 凍結液物性; 細胞凍結保存; アクアポリン; ガラス化; 分光測定

細胞の凍結保存は半世紀以上前に開発され、畜・水産業等で実用化されている技術である。そのメカニズムは「細胞外水の凍結による細胞からの脱水と細胞内水のガラス化」であるとされている。しかし神経細胞など高需要でも凍結保存できていない細胞種があり、細胞内水のガラス化も実験的に証明されていない。そこで本研究は凍結保存メカニズムを実験的に再検討するため、天然の凍結保護剤（CPA)であるトレハロースを用い、トレハロース輸送タンパク質を発現させた細胞と、透水性を向上させた細胞の2種類のユニークな細胞系を使って、凍結過程における細胞内水の状態を変えた実験を行う。そして細胞を顕微鏡観察しながら水の状態を3種類の分光（Raman、近赤外、誘電）測定で観測し、細胞からの脱水過程の評価と、細胞内水の状態評価とを行うことを目標としている。令和4年度は、まず分光測定をする際に細胞内外の状態を区別して計測できるようにするため、接着状態の細胞を凍結保存する技術を開発した。実験で使用する2種類の細胞系について、トレハロースや既存のCPAであるDMSO等を使った実験を行い、緩慢凍結法で接着細胞の凍結保存が可能かを調べた。一方各分光学的手法に関して、細胞を含まない凍結液を3種の手法で測定し、各測定法の確認と細胞のバックグラウンドとなる凍結液の基盤スペクトル等を収集した。特にCPAとして用いたトレハロースと水溶液との相互作用について、各分光学的手法から得られる情報を集約した。なお本年度は「顕微Raman分光測定用試料温調装置」を導入したが、半導体不足等による物資調達困難な状況が生じ、納期が予定より大幅に遅延した。そのため、上記分光学的測定は室温で実施した。

Cell <s:1> freezing and preservation に more than half a century ago に development され, で practical application technology in the livestock and aquaculture industry されて る る である. Youdaoplaceholder0 そ メカニズム メカニズム る "extracellular water <s:1> freezes による cells ら ら dehydrating と intracellular water ガラス ガラス dehydrating" であるとされて であるとされて る る る. し か し god 経 cells な ど high need で も freezing preservation で き て い な い cells of が あ り, cells in the inland waters の ガ ラ ス change も be 験 に prove さ れ て い な い. そ こ で は this study freezing preservation メ カ ニ ズ ム を be 験 に again beg す 検 る た め, natural の freeze protection tonic (CPA) で あ る ト レ ハ ロ ー ス を い, ト レ ハ ロ ー ス conveying タ ン パ ク qualitative を 発 now さ せ を upward と た cells and permeability さ せ た cells の 2 kinds の ユ ニ ー ク な cell line を make っ て, freezing process に お け る cells in the inland waters の State を changes えた experiment を rows う. そ し て cells を 顕 micromirror 観 examine し な が ら water の state を 3 kinds の spectroscopic (Raman, nearly bare outside, electricity) lure determination で 観 し, cell か ら の の dehydration process review 価 と, cells in the inland waters の status review 価 と を line う こ と を target と し て い る. And 4 year は, ま ず spectral photometry を す る interstate に の state し を difference between outside and inside of cell て measuring で き る よ う に す る た め を freezing preservation, then state の cells す る technology を open 発 し た. Use be 験 で す る 2 kinds の cell line に つ い て, ト レ ハ ロ ー ス や existing の CPA で あ る DMSO を make っ た be 験 を い, slow freezing method で の freezing preservation が then cells might か を adjustable べ た. Side of each optical に masato し て, cell を ま な い freeze liquid を three の で determination し, each measurement の confirm と cells の バ ッ ク グ ラ ウ ン ド と な る freeze liquid の base plate ス ペ ク ト ル etc を 収 set し た. Special に CPA と し て in い た ト レ ハ ロ ー ス と aqueous と の interaction に つ い て, each optical technique か ら must ら れ る intelligence を intensive し た. な お this year は "顕 micro Raman spectral photometry with sample temperature adjustable device" を import し た が and the shortage of semiconductor に よ る supplies the condition of difficult な が じ, satisfied が designated よ り sharply に 遅 delay し た. Youdaoplaceholder0 ため ため, optical determination of the upper score そ room temperature で actual application た.

项目成果

細胞のガラス上接着状態における凍結保存条件の検討

玻璃粘附细胞冷冻保存条件的检查

• 发表时间: 2022
• 作者: 渡邉孝輝;黄川田隆洋;山崎憲慈;内田努
• 通讯作者: 内田努

トレハロースを用いたアクアポリン4発現CHO細胞の凍結速度依存性

使用海藻糖表达水通道蛋白 4 的 CHO 细胞的冷冻速率依赖性

• 发表时间: 2022
• 作者: 松尾菫;山崎憲慈;安井正人;阿部陽一郎;内田努
• 通讯作者: 内田努

IR and Raman Spectroscopy of Clathrate Hydrates in “Clathrate Hydrates: Molecular Science and Characterization"

“笼形水合物：分子科学与表征”中笼形水合物的红外和拉曼光谱

• 发表时间: 2022
• 作者: T. Uchida;A. K. Sum
• 通讯作者: A. K. Sum