善玉コレステロール（ＨＤＬ）形成におけるヒトＡＢＣＡ１の細胞外ドメインの機能解析

人ABCA1胞外结构域在好胆固醇（HDL）形成中的功能分析

基本信息

批准号：
13J02851
负责人：
石神正登
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J02851/
关键词：
ABCトランスポーター ABCA1 善玉コレステロール HDL コレステロール ABCAl リン脂質ダイマー化

项目摘要

これまでに、予備的な実験により、ABCA1発現細胞をトリプシン処理すると、ABCA1の細胞外ドメインが切断されていると同時に、培地中にコレステロールが放出されることを見出した。この結果は、ABCA1の細胞外ドメイン内に、輸送されたコレステロールが蓄積していることを示唆している。一方で、全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を用いた解析により、ABCA1はHDL産生途上で一時的にダイマー化し、細胞膜上で停止するという特異的な挙動を示すことが明らかとなった。以上のことから、ABCA1はATP加水分解に伴ってコレステロールを輸送し、細胞外ドメイン内に溜め込むとともにダイマー化するという仮説をたて、ABCA1のダイマー化の生理的意義を明らかにすることを目的として研究を進めた。ABCA1と最もアミノ酸配列相同性の高いタンパク質であるABCA7をTIRF顕微鏡で観察したところ、ABCA7はABCA1とは異なり細胞膜上を自由拡散することがわかった。ABCA7とのアミノ酸配列の比較から、ABCA1のダイマー化に関わるドメインを探索し、C末端付近の3つのロイシン残基をすべてアラニンに置換した結果、ダイマー化しないABCA1変異体であるABCA1-3LAの作製に成功した。その後、Alexa蛍光色素を付加したapoA-IとBODIPY蛍光団を付加したコレステロールを用いた蛍光ゲル濾過クロマトグラフィー解析により、ABCA1はサイズの異なる2種類のHDLを産生する一方で、ABCA1-3LAは小さいサイズのHDLを主に産生することを示した。以上の結果から、ABCA1のダイマー化は大きいサイズのHDLの産生に必要であることが示唆された。以上の結果は、HDL産生におけるABCA1のダイマー化の意義を初めて明らかにしたものである。

以前，初步实验发现，表达ABCA1的细胞的胰蛋白胰蛋白酶化裂解了ABCA1的细胞外结构域，同时在培养基中释放胆固醇。该结果表明，转运的胆固醇会在ABCA1的细胞外域内积聚。另一方面，使用总反射荧光（TIRF）显微镜进行分析表明，ABCA1在HDL产生过程中暂时二聚并在细胞膜上停止。基于上述情况，我们确定了一个假设，即ABCA1将胆固醇和ATP水解一起运输，在细胞外域内积累并二聚在其内，并进行了研究，目的是阐明ABCA1二聚体的生理意义。当在TIRF显微镜下观察到具有最高氨基酸序列同源性的ABCA7，即具有最高氨基酸序列的蛋白质时，发现ABCA7与ABCA1不同，在细胞膜上自由扩散。通过将氨基酸序列与ABCA7进行比较，我们搜索了涉及ABCA1二聚化的结构域，并用丙氨酸代替了C-末端附近的所有三个亮氨酸残基，从而创建了ABCA1-3LA，这是一种非蚀刻的ABCA1突变体。随后，荧光凝胶过滤色谱分析使用胆固醇和添加的Alexa荧光染料和添加的荧光团添加的胆固醇表明ABCA1产生两种不同的HDL类型的HDL类型的HDL，而ABCA1-3LA主要产生小尺寸。上述结果表明，ABCA1的二聚化对于生产大型HDL是必需的。以上结果揭示了ABCA1首次在HDL产生中的二聚化意义。