産業微生物由来アミノ酸輸送体の構造解析と基質輸送メカニズムの解明

工业微生物来源的氨基酸转运蛋白的结构分析和底物转运机制的阐明

• 批准号: 13J03082
• 负责人: 鈴木 聡美
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J03082/
• 关键词: アミノ酸輸送体; AspT; リポソーム; 輸送能解析; 基質輸送メカニズム; 結晶化; キネティクス; OGMラベリング; 基質結合; 構造変化; 輸送体; AAExファミリー; GxxxG

本研究は輸送体の改変により、将来的に発酵産業界における有用物質生産の高効率化を目指し、微生物の輸送メカニズムの解明を行ったものである。研究対象となる輸送体は、産業利用例のある微生物由来の輸送体蛋白質であり、アスパラギン酸（L-Asp）とアラニン（L-Ala）という二つのアミノ酸を交換輸送する。これまで、酵素学的解析から、基質透過経路の同定や基質結合部位が輸送基質ごとに異なることが明らかにされている。本研究では引き続き酵素学的アプローチとして、１（１）L-Asp、L-Ala のヘテロ交換輸送がどのように行われているのか解析すると共に、１（２）基質の推定透過経路内の一アミノ酸残基に注目し、輸送における機能の解明を行った。また、AspTの輸送における機能の全容解明に挑むため、結晶構造解析を考えている。昨年度は、更なる高発現系の改良に成功した。今年度は実際結晶化スクリーニングに挑むと共に、２耐熱性ホモログのスクリーニングを行い、より結晶化しやすい状況の探索を行った。１（１）ヘテロ交換輸送の解明に関しては、現在論文作成中であり、新規性確保のため詳細は省略させていただく。１（２）では、構造の安定化に寄与するとされる部位のうち、76番目のアルギニン残基を様々なアミノ酸に置換して輸送能を調べた。その結果、リジンに置換した変異体ではワイルドタイプの約2倍の輸送能を示した。これは輸送体の改変が産業応用に期待できる結果となった。２では後輩の指導・アドバイスの面で関わった。現在、耐熱性ホモログのスクリーニング、発現の確認を終えたところである。

This study aims to improve the efficiency of the production of useful substances in the future development industry, and to clarify the development of microbial transport systems. Study on the transport of proteins from microbial origin and industrial use examples. L-Asp and L-Ala are two kinds of acid exchange transport. The enzyme analysis, matrix transmission pathway and matrix binding site are the same as the transport matrix. This study is aimed at: (1) understanding the function of L-Asp and L-Ala in enzyme exchange and transport;(2) estimating the function of L-Asp and L-Ala in the transport pathway; and (3) understanding the function of L-Asp and L-Ala in enzyme transport. The analysis of crystal structure and transport function of AspT are discussed. Last year, the improvement of high-speed development system was successful. This year's crystallization process is to explore the heat resistance and crystallization conditions. 1 (1) Exchange and transport of the solution to the problem, now the paper to create a new regulation to ensure that the details of the omission 1.(2) The structure of the protein was stabilized and the protein was transferred to the protein by acid substitution. As a result, the transport energy of the mixture is about twice as high as that of the original mixture. The result of the transformation of the transport system into an industrial one is expected. 2. The guidance of the younger brother. Now, the heat resistance, the discovery, the confirmation of the final.

项目成果

醤油乳酸菌 Tetragenococcus halophilus 由来アスパラギン酸：アラニン交換輸送体の基質輸送機構

酱油乳酸菌嗜盐四联球菌中的天冬氨酸：丙氨酸交换转运蛋白的底物转运机制

• 发表时间: 2015
• 作者: 鈴木聡美;木村拓哉;七谷圭;阿部敬悦
• 通讯作者: 阿部敬悦

GxxxG motif of transmembrane region 3 (TM3) is critical for the function of bacterial L-Aspartate : Alanine Antiporter AspT

跨膜区 3 (TM3) 的 GxxxG 基序对于细菌 L-天冬氨酸的功能至关重要：丙氨酸逆向转运蛋白 AspT

• 发表时间: 2013
• 作者: 高橋良輔，斎藤俊輔;鈴木聡美
• 通讯作者: 鈴木聡美

Studies of Transport Mechanism of The Bacterial Aspartate : Alanine Antiporter (AspT)-Functional Analysis of The Amino Acid Residues in The Transmembrane Domain 3 (TM3) of AspT-

细菌天冬氨酸转运机制的研究：丙氨酸逆向转运蛋白（AspT）-AspT跨膜结构域3（TM3）氨基酸残基的功能分析-

• 发表时间: 2013
• 作者: 小久保充、橋場康人;満田和真;酒向重行;諸隈智貴;土居守;Hanindyo Kuncarayakti;森鼻久美子;伊藤洋一; 新井彰;鈴木聡美
• 通讯作者: 鈴木聡美

乳酸菌由来 L-Aspartate:L-Alanine 交換輸送体 AspT 第 3 膜貫通領域システイン置換体を用いた蛍光修飾による AspT の構造変化の解析

L-天冬氨酸：源自乳酸菌的L-丙氨酸交换转运蛋白分析由于在 AspT 第三跨膜区使用半胱氨酸替代物进行荧光修饰而导致的 AspT 结构变化

• 发表时间: 2014
• 作者: 鈴木聡美;木村拓哉;笹原綾子;七谷圭;阿部敬悦
• 通讯作者: 阿部敬悦

Functional analysis of the amino acid residues in the transmembrane domain (TM3) of the L-Aspartate : L-Alanine Antiporter AspT-Functional analysis of the amino acid exchanger AspT-

L-天冬氨酸跨膜结构域 (TM3) 中氨基酸残基的功能分析：L-丙氨酸逆向转运蛋白 AspT-氨基酸交换剂 AspT- 的功能分析

• 发表时间: 2013
• 作者: Yasuteru Shigeta;Takeshi Baba;Hiroyuki Ando;Ryota Nakamura;Taku Takebayashi;Ryohei Kishi;and Masayoshi Nakano;鈴木聡美
• 通讯作者: 鈴木聡美