ポーリネラ・クロマトフォラの珪酸沈着と被殻構築に関わるタンパク質の同定と進化

前年度はシリカバイオミネラリゼーションの進化を探るため、新規に確立したポーリネラ・クロマトフォラの株を用いてトランスクリプトーム解析を行い、データベースから珪酸質被殻関連タンパク質を探索し、シリカトランスポーター遺伝子を同定した。シリカトランスポーターはこれまでに、ストラメノパイル系統群に属する珪藻とオピストコンタ系統群の襟べん毛虫からのみ報告であったが、今回リザリア系統群に属するポーリネラにおいて初めて同定した。しかし、アミノ酸配列は多様性が高く、今回同定したシリカトランスポーターが細胞膜上もしくは珪酸沈着小胞の膜上に存在するか否かはわかっていない。そこで、本年度はシリカトランスポーターに対する抗体の作成を試みた。ペプチド抗体および発現タンパク質を用いたポリクローナル抗体の作成を試みたが、ウエスタンブロット及び前年度に確立した間接蛍光抗体法を用いた細胞染色の結果、特異性の高い抗体は作出されなかった。さらに、新規に確立した増殖速度の比較的早い株を用いてポーリネラを大量培養し、単離珪酸質鱗片からタンパク質を抽出してLC-MS/MSを用いて同定を行った結果、新規被殻関連タンパク質が前年度に同定されている。しかし、SDS-PAGEの結果では、新規珪酸質被殻関連タンパク質を含むであろうバンドが複数検出されており、さらにたくさんのタンパク質同定をする必要があると考え、LC-MS/MSにおける試料作成や分析条件の改良を行った。その結果、さらに多くのタンパク質を単離鱗片から検出することができた。現在、バイオロジカルレプリケートをとり、論文投稿の準備中である。

前年度はシリカバイオミネラリゼーションの進化を探るため、新規に確立したポーリネラ・クロマトフォラの株を用いてトランスクリプトーム解析を行い、データベースから珪酸質被殻関連タンパク質を探索し、シリカトランスポーター遺伝子を同定した。シリカトランスポーターはこれまでに、ストラメノパイル系統群に属する珪藻とオピストコンタ系統群の襟べん毛虫からのみ報告であったが、今回リザリア系統群に属するポーリネラにおいて初めて同定した。しかし、アミノ酸配列は多様性が高く、今回同定したシリカトランスポーターが細胞膜上もしくは珪酸沈着小胞の膜上に存在するか否かはわかっていない。そこで、本年度はシリカトランスポーターに対する抗体の作成を試みた。ペプチド抗体および発現タンパク質を用いたポリクローナル抗体の作成を試みたが、ウエスタンブロット及び前年度に確立した間接蛍光抗体法を用いた細胞染色の結果、特異性の高い抗体は作出されなかった。さらに、新規に確立した増殖速度の比較的早い株を用いてポーリネラを大量培養し、単離珪酸質鱗片からタンパク質を抽出してLC-MS/MSを用いて同定を行った結果、新規被殻関連タンパク質が前年度に同定されている。しかし、SDS-PAGEの結果では、新規珪酸質被殻関連タンパク質を含むであろうバンドが複数検出されており、さらにたくさんのタンパク質同定をする必要があると考え、LC-MS/MSにおける試料作成や分析条件の改良を行った。その結果、さらに多くのタンパク質を単離鱗片から検出することができた。現在、バイオロジカルレプリケートをとり、論文投稿の準備中である。