Engineering Temperate Bacteriophages for Induced Secretion of Proteins and Peptides by Oral Streptococcus Mitis

点击翻译按钮获取中文摘要

ABSTRACT  Commensal bacterial populations in the oral cavity not only play a pivotal role in the maintenance of healthy  oral mucosa, but also makes for attractive targets for induced secretion of therapeutic molecules, such as  peptide/protein therapeutics or immunogens for oral vaccines. Studies have shown that genetically engineered  commensals inoculated in germ­free animals can produce therapeutically relevant proteins, such as  immunogens that elicit mucosal antibody production. However, clinical translation of these these live­bacterial  therapies faces many hurdles, including (i) difficulty in displacing existing commensal populations with the  engineered variants, (ii) safety concerns with the engineered variants, and (iii) characterization, storage and  handling of live bacteria.  With the exception of fecal transplants in patients who have received extensive  antibiotics therapy, no live bacteria are currently used as a therapy in clinical setting.  In this proposal, I seek to  develop an alternative strategy that allows direct modification of existing commensal populations.  Specifically,  I will engineer bacterial viruses, or bacteriophages, to genetically modify commensal bacterial populations at  mucosal surfaces ​in situ​. Bacteriophages present no human toxicity or pathogenicity, and are efficient  transduction vectors with high specificity.  However, to date, virtually all bacteriophage development focuses  on using ​lytic phages​ to kill specific pathogenic bacteria (i.e. bacteriophages as a new class of anti­microbial),  and little work has been done on engineering temperate ​ ​phages to modify the protein expression and secretion  profiles of commensal bacteria.  The primary research goal of this F32 training grant is to demonstrate the  proof of concept that engineered phages can mediate efficient transfer of genetic material to commensal  bacteria. In Aim 1, I will isolate three temperate bacteriophage from different S​ treptococcus Mitis​ strains,  introduce a reporter gene (Tag­RFP) into its genome, and assess their potency in transducing S​ . Mitis​ isolated  from human saliva via flow cytometry. Aim 2 extends this method to the display and secretion of model  therapeutic molecules. Using the most potent bacteriophage vector, I will incorporate model proteins linked to  bacterial secretion/display tags, and measure the extent that these proteins will be secreted by or displayed on  the same human derived ​S. mitis​.  In Aim 3, using gnotobiotic mice inoculated with human S​ . mitis​, I will  quantify the amount of secreted protein in the oral and gastrointestinal mucosa induced by engineered phage  particles, as well as antibody response to proteins presented on the surface of transduced ​S. mitis​. The results  will provide important insights into the potential use of temperate phages to modify commensal populations for  delivery of specific protein therapies and immunogens.