Engineering Temperate Bacteriophages for Induced Secretion of Proteins and Peptides by Oral Streptococcus Mitis

摘要 口腔中的共生菌群不仅在维持健康中起着关键作用， 口腔粘膜，而且还成为诱导治疗分子分泌的有吸引力的靶点， 用于口服疫苗的肽/蛋白质治疗剂或免疫原。研究表明，基因工程 在无菌动物中接种的益生菌可以产生治疗相关的蛋白质，如 引起粘膜抗体产生的免疫原。然而，这些活细菌的临床转化 治疗面临着许多障碍，包括（i）难以用 工程化变体，（ii）工程化变体的安全性问题，和（iii）表征、储存和 处理活细菌。 除了接受过大量粪便移植的患者外， 抗生素治疗，目前没有活细菌在临床环境中用作治疗。 在这一建议中，我力求 开发一种替代策略，允许直接修改现有的生物种群。 具体地说， 我将设计细菌病毒，或噬菌体，以遗传方式改变细菌种群， 原位粘膜表面。噬菌体对人体没有毒性或致病性， 具有高特异性的转导载体。 然而，到目前为止，几乎所有噬菌体的发展都集中在 在使用裂解性噬菌体杀死特定病原菌（即噬菌体作为一类新的抗微生物噬菌体）时， 而工程温度方面的工作却很少 修饰蛋白质的表达和分泌 肠道细菌的特征。 F32培训补助金的主要研究目标是证明 工程化的大肠杆菌可以介导遗传物质有效转移到大肠杆菌的概念证明 细菌目的1：从不同的缓症链球菌菌株中分离三种温和噬菌体， 将报告基因（Tag_RFP）导入其基因组中，并评估其转导S .缓解孤立 从人类唾液中分离出来目的2将该方法推广到模型的显示和分泌 治疗分子使用最有效的噬菌体载体，我将把模型蛋白连接到 细菌分泌/展示标签，并测量这些蛋白质将被细菌分泌或展示的程度。 相同的人源S.缓解。 目的3：用人沙门氏菌感染的无菌小鼠。米提斯，我会的 定量由工程化噬菌体诱导的口腔和胃肠道粘膜中的分泌蛋白的量 颗粒，以及抗体对转导的S.缓解。结果 将提供重要的见解，潜在的使用温带杂草，以修改草原种群， 递送特定的蛋白质疗法和免疫原。

ABSTRACT  Commensal bacterial populations in the oral cavity not only play a pivotal role in the maintenance of healthy  oral mucosa, but also makes for attractive targets for induced secretion of therapeutic molecules, such as  peptide/protein therapeutics or immunogens for oral vaccines. Studies have shown that genetically engineered  commensals inoculated in germ­free animals can produce therapeutically relevant proteins, such as  immunogens that elicit mucosal antibody production. However, clinical translation of these these live­bacterial  therapies faces many hurdles, including (i) difficulty in displacing existing commensal populations with the  engineered variants, (ii) safety concerns with the engineered variants, and (iii) characterization, storage and  handling of live bacteria.  With the exception of fecal transplants in patients who have received extensive  antibiotics therapy, no live bacteria are currently used as a therapy in clinical setting.  In this proposal, I seek to  develop an alternative strategy that allows direct modification of existing commensal populations.  Specifically,  I will engineer bacterial viruses, or bacteriophages, to genetically modify commensal bacterial populations at  mucosal surfaces ​in situ​. Bacteriophages present no human toxicity or pathogenicity, and are efficient  transduction vectors with high specificity.  However, to date, virtually all bacteriophage development focuses  on using ​lytic phages​ to kill specific pathogenic bacteria (i.e. bacteriophages as a new class of anti­microbial),  and little work has been done on engineering temperate ​ ​phages to modify the protein expression and secretion  profiles of commensal bacteria.  The primary research goal of this F32 training grant is to demonstrate the  proof of concept that engineered phages can mediate efficient transfer of genetic material to commensal  bacteria. In Aim 1, I will isolate three temperate bacteriophage from different S​ treptococcus Mitis​ strains,  introduce a reporter gene (Tag­RFP) into its genome, and assess their potency in transducing S​ . Mitis​ isolated  from human saliva via flow cytometry. Aim 2 extends this method to the display and secretion of model  therapeutic molecules. Using the most potent bacteriophage vector, I will incorporate model proteins linked to  bacterial secretion/display tags, and measure the extent that these proteins will be secreted by or displayed on  the same human derived ​S. mitis​.  In Aim 3, using gnotobiotic mice inoculated with human S​ . mitis​, I will  quantify the amount of secreted protein in the oral and gastrointestinal mucosa induced by engineered phage  particles, as well as antibody response to proteins presented on the surface of transduced ​S. mitis​. The results  will provide important insights into the potential use of temperate phages to modify commensal populations for  delivery of specific protein therapies and immunogens.