Molecular mechanisms of gasdermins and pyroptosis

摘要 炎性小体是参与针对炎症的免疫防御的关键先天免疫信号传导平台。 感染和自身免疫性/自身炎症性疾病，如多发性硬化症、糖尿病和阿尔茨海默病 疾病焦亡是由炎症性半胱天冬酶-caspase-1、4、5或11在刺激典型和 非典型炎性小体。尽管最近在GSDMD的鉴定和表征方面取得了进展 作为焦亡的效应物，GSDMD从自身抑制的 对于胱天蛋白酶识别和切割的静止状态仍然不清楚。缺乏机械性 对GSDMD介导的焦亡的理解阻碍了新的 抗感染和自身免疫/自身炎性病症的治疗剂。本提案针对关键差距 在我们对GSDMD/炎性半胱天冬酶介导的细胞凋亡的理解中， 功能接近。我们假设GSDMD通过以下途径维持在自抑制构象： 其N-端（GSDMD-N）和C-端（GSDMD-C）结构域之间的分子内结构域相互作用。等 构象被炎性半胱天冬酶识别，所述半胱天冬酶在接头区切割以释放 自抑制和促进膜孔形成。 我们提出以下具体目标，以测试 以上假设。目标1。定义GSDMD维持其自动抑制状态的机制，以及 小分子工具化合物如何调节这种自身抑制。我们将描述这个结构 GSDMD结构域和全长蛋白质在其自抑制状态下使用主要的结构方法， 与通过生物化学技术分析GSDMD-CNON和GSDMD-CNOC相互作用一致。的作用 在沙门氏菌感染过程中的分子内结构域界面-沙门氏菌诱导的焦亡将使用 GSDMD-用突变体GSDMD重建的GSDMD缺陷细胞系。 我们的方法的一个独特之处是， 将从化学文库筛选中鉴定的GSDMD-E2结合化合物并入上述努力中 研究小分子工具化合物对GSDMD和焦亡的调节作用。 目标二。 定义 gasdermin识别和裂解的炎症半胱天冬酶的机制。我们将阐明 caspase-14和caspase-11从酶原转化为活性构象的基础， 表征了我们将研究这些半胱天冬酶识别GSDMD的机制，这可能涉及 连接肽和GSDMD的三级结构。总之，这个项目将描绘分子 焦亡过程中GSDMD自身抑制和激活的潜在机制，确定小分子 工具化合物，并表征其在细胞凋亡调节中的作用模式。这不仅会 为GSDMD的结构和功能提供了独特的见解，但可能会刺激治疗方法的发展 针对炎症性疾病

Abstract  The  inflammasomes  are  crucial  innate  immune  signaling  platforms  implicated  in  immune  defense  against  infections  and  autoimmune/autoinflammatory  disorders  such  as  multiple  sclerosis,  diabetes,  and  Alzheimer’s  disease. Pyroptosis is triggered by inflammatory caspases-­1, 4, 5, or 11 upon stimulation of the canonical and  noncanonical inflammasomes. Despite the recent progress on the identification and characterization of GSDMD  as an effector of pyroptosis, the molecular events underlying the transformation of GSDMD from an autoinhibited  resting state to the recognition and cleavage by caspases has remained poorly defined. The lack of mechanistic  understanding  of  GSDMD-­mediated  pyroptosis  has  hampered  progress  on  the  development  of  novel  therapeutics against infections and autoimmune/autoinflammatory disorders. This proposal targets critical gaps  in  our  understanding  of  GSDMD/inflammatory  caspase-­mediated  pyroptosis  using  complementary  structure-­ function approaches. We hypothesize that GSDMD is maintained in an autoinhibited conformation through  intramolecular domain interactions between its N-­ (GSDMD-­N) and C-­terminal (GSDMD-­C) domains. Such  conformation  is  recognized  by  inflammatory  caspases  that  cleave  at  the  linker  region  to  release  the  autoinhibition  and  facilitate  membrane  pore  formation.  We  propose  the  following  specific  aims  to  test  the  above hypothesis. Aim 1. Define the mechanism through which GSDMD maintains its autoinhibited state, and  how such autoinhibition may be regulated by small molecule tool compounds. We will characterize the structure  of the GSDMD domains and the full-­length protein in its autoinhibited state using primarily structural approaches,  in concert with analysis of the GSDMD-­N and GSDMD-­C interactions through biochemical techniques. The role  of  the  intramolecular  domain  interface  during  Salmonella  infection-­induced  pyroptosis  will  be  probed  using  GSDMD-­deficient  cell  lines  reconstituted  with  mutant  GSDMD.  A  unique  feature  of  our  approach  is  the  incorporation of GSDMD-­binding compounds identified from chemical libraries screening into the above efforts  to  investigate  the  regulation  of  GSDMD  and  pyroptosis  by  small  molecule  tool  compounds.  Aim  2.  Define  the  mechanisms of gasdermin recognition and cleavage by inflammatory caspases. We will elucidate the molecular  basis  of  the  conversion  of  caspases-­4  and  11  from  zymogens  to  active  conformation,  which  has  been  poorly  characterized. We will investigate the mechanism of GSDMD recognition by these caspases, which may involve  both the linker peptides and tertiary structure of GSDMD. In summary, this project will delineate the molecular  mechanisms  underlying  the  autoinhibition  and  activation  of  GSDMD  during  pyroptosis,  identify  small  molecule  tool compounds and characterize their mode of action in the context of pyroptosis regulation. This will not only  furnish  unique  insights  on  GSDMD  structure  and  function,  but  may  stimulate  the  development  of  therapeutics  that target inflammatory disorders.