病毒感染中p100蛋白与I-dsRNA相互作用的分子机制研究

病毒感染后胞浆产生应激颗粒，与I-dsRNA，p100均密切相关。本项目以病毒处理Hela 细胞为模型，从p100蛋白表达，SGs形成，蛋白质磷酸化等方面着手，探讨p100蛋白在病毒感染引起的应激颗粒中的可能调控作用。首先我们通过免疫荧光实验来确定p100蛋白是否存在于病毒引起的应激颗粒中。由于本实验室获得的MRV病毒毒株毒力太弱，因此换用了柯萨奇B3病毒感染Hela细胞，并以此作为研究模型。柯萨奇B3病毒感染Hela细胞后，引起了应激颗粒的形成，同时p100与TIA-1存在共定位现象，说明p100蛋白存在于病毒感染形成的应激颗粒中。在此基础上我们进行了机制研究，为了确定p100蛋白是否在病毒应激过程中受到影响或是发挥作用，我们采用转染Poly IC模拟病毒感染的过程。我们发现当以Poly IC模拟病毒感染可以引起HeLa细胞在应激条件下发生多聚糖体的解聚表明此时细胞的蛋白翻译过程被中止。利用磷酸化抗体，采用LI-COR Odyssey®近红外双色激光成像系统，我们发现应激条件下对p100蛋白的蛋白表达水平无变化，但其自身Tyr、Thr以及Ser磷酸化水平增加，同时翻译起始因子eIF2蛋白的ser51发生磷酸化。最后我们用in-cell Odyssey法分析了p100-T103位点在HeLa细胞内的磷酸化变化。实验发现p100-T103磷酸化并不是随着应激时间的延长呈直线式上升，而表现为一定的波动式；表明在应激状态下p100-T103位点可能存在一个动态的磷酸化/去磷酸化动态变化过程。为进一步探讨JNK和p100蛋白在应激中的相互作用，我们给予细胞JNK抑制剂，观察其对于应激颗粒形成的影响，结果显示在应激条件下，在JNK抑制剂处理后， T103的磷酸化水平明显降低，也从另一个方面证明了激活的JNK对于T103的磷酸化作用。同时免疫荧光结果显示当给予JNK抑制剂以后应激颗粒的形成也受到一定影响。有意思的是实验发现在应激与非应激条件下，核内的磷酸化T103都是明显多于核外的，而且并没有受到抑制剂的影响。于是我们分离了胞浆、胞核裂解液，发现在HeLa细胞的细胞核中并没有JNK存在，这就暗示我们在核内可能还存在着其他能够直接磷酸化T103的激酶。而且在该刺激条件下，还发现p100蛋白有出核的现象，至于出核的p100蛋白是参与什么细胞生物学功能还有待进一步研究。