let-7家族miRNA调控猪卵泡闭锁的分子机制研究

课题组采用miRNA芯片技术发现，猪健康与闭锁卵泡let-7 microRNA家族的表达水平存在显著差异。本课题试图在验证此研究结果的基础上，深入研究let-7 microRNA表达差异调控猪卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的分子机制。通过优化引物设计，试验成功实现了let-7 家族各成员间的区分，采用实时定量PCR技术检测发现，与健康卵泡相比，早期闭锁与闭锁卵泡let-7a、let-7b、let-7c和let-7i的表达水平显著降低，而let-7g在猪卵泡闭锁过程中显著升高；试验结果与前期芯片结果一致。进一步的研究发现，体外培养的猪卵泡颗粒细胞过表达let-7g microRNA后，细胞的凋亡显著增加；凋亡相关基因CASP3、BAX和BIM的表达水平上升明显，而抗凋亡基因BCL-2 和MCL-1显著下调；并且检测到转录因子FoxO1表达上调与去磷酸化后的入核。在此基础上，采用生物信息学手段，在let-7g下游靶基因中筛选到与FoxO1磷酸化相关的候选基因MAP3K1，试验发现，颗粒细胞中let-7g过表达抑制了MAP3K1的表达，荧光素报告系统的试验进一步证实，MAP3K1是let-7g的靶基因，采用RNAi技术抑制猪颗粒细胞中MAP3K1表达后细胞的凋亡率显著下降。综上，猪卵泡颗粒细胞中let-7g表达上调抑制了下游靶基因MAP3K1的表达，从而上调FoxO1表达与去磷酸化水平，FoxO1入核诱导凋亡相关基因的表达，促进了卵泡颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁。