I类透明质酸合成酶催化能域快速收敛定位与解析

透明质酸合成酶（HAS）是一种膜蛋白，是合成透明质酸（HA）的核心酶。它可以同时实现两种不同单体底物分子及两条延伸HA链段的结合、两种底物分子的糖基转移活性以及HA产物链的过膜转运等7种不同的功能，但具体催化功能域的活性基团、模体结构、位置与催化机制等都尚未解析。通过巧妙设计的区间→位点快速收敛定位的新思路和基因末端渐短截取的新方法，在对来源于S. equisimilis的SeHAS重新设计合成了大肠杆菌密码子偏爱性基因的基础上，设计突变了新的组成型启动子，实现了一系列截短SeHAS的表达；以HA产量、分子量（Mw）、HAS酶活和细胞密度为指标进行考察，成功发现了含有催化关键位点的四个重要区间：74-167 aa, 234-290 aa, 290-300 aa和409-417aa。进一步以hasA-hasB共表达高产体系为对象，通过序列比对和大量的定点突变，在上述四个区间发现了14个催化必需残基，分别属于74-YNE-76等6个模体域。提出了延伸中的HA链可能通过与SeHAS中B-rich motif结合从而实现跨膜“行进”和转运的新概念。基因截短和突变实验证实了C-末端一个motif对HA合成的重要作用。在SeHAS的6个B-rich motif中，选择2个为模式肽段进行定点突变，发现两个肽段中多数带正电的氨基酸残基都是SeHAS催化功能的关键位点。最后，通过设计水溶液中B-rich motif肽段与HA结合的沉淀实验以及HA-聚丙烯酰胺凝胶截留实验，得到了HA与B-rich motif多肽结合作用的定性与半定量描述。初步揭示了HA链在HAS内部“步移行进”、并最终分泌出胞外的机制。其中，还在一个B-rich肽段中发现了导致SeHAS酶活显著下降的负电氨基酸残基，是关键的功能位点之一。提出了SeHAS可能具有双催化活性中心。还通过转录因子突变强化了SeHAS表达和HA的合成，研究了SeHAS在谷氨酸棒杆菌中的重组表达，为腈水合酶、头孢菌素C酰化酶等生物酶的结构与功能研究提供了方法借鉴。