蛋白激酶PAK5在骨肉瘤多药耐药中的功能及分子机制研究

骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤，在局部呈侵袭性生长并容易发生远处转移。p21活化激酶5（p21-activated kinase 5，PAK5）为PAKs家族中新近发现的成员，在细胞骨架重组、细胞生长、增殖、分化以及凋亡等一系列功能中发挥重要作用。近年有研究发现PAK5参与了胃癌、肠癌等肿瘤的发生发展，但PAK5在骨肉瘤中的生物学功能尚不明确。本研究的目的是通过体内外实验探索PAK5对骨肉瘤生物学行为（如侵袭转移、多药耐药等）以及患者预后的影响，并探讨其相关的分子机制。本研究首先设计并化学合成了siRNA抑制PAK5的表达，发现显著上调MG-63/DXR 细胞对于阿霉素、顺铂、异环磷酰胺的敏感性。回顾性分析新辅助化疗骨肉瘤患者PAK5表达与化疗敏感性的关系，发现瘤组织过表达PAK5的患者肿块退缩不足25%，初步证实PAK5与肿瘤耐药密切相关。PAK5在骨肉瘤组织和细胞系中过表达，进一步构建shRNA-PAK5病毒载体，转染骨肉瘤Saos-2细胞株，发现其增殖和集落形成能力被显著抑制，凋亡显著增加，同时小鼠移植瘤模型证明其肿瘤形成能力显著下降。肿瘤细胞抗凋亡是触发瘤细胞多药耐药的重要机制，本研究体内外实验均证实，干扰PAK5表达显著诱导了骨肉瘤细胞凋亡，这可能是PAK5影响骨肉瘤细胞耐药的机制。本研究回顾性分析PAK5基因表达与临床预后的相关性，发现PAK5与骨肉瘤化疗耐药、肺转移均密切相关，骨肉瘤组织高PAK5表达与更短的总体生存率相关。肺是骨肉瘤最常见的转移部位，我们进一步实验证明，敲除PAK5后骨肉瘤细胞侵袭能力显著下调，并发现MMP-2在PAK5沉默后也显著下调。回顾性分析发现PAK5表达在肺转移组织中比原发骨肉瘤组织中更高，高表达PAK5的组织MMP-2表达水平也升高。研究还发现肿瘤大小、分期、局部复发、肺转移及PAK5表达水平是影响骨肉瘤预后的因素，且PAK5高表达能降低化疗有效率。多因素分析显示PAK5表达水平及肺转移是影响骨肉瘤预后的独立因素。本研究还进一步探索了逆转骨肉瘤多药耐药(MDR)的机制，应用西罗莫司联合细胞毒药物处理MG63/DXR细胞，发现西罗莫司可逆转MDR，通过miRNA microarray、原位杂交等分析，揭示西罗莫司通过上调miR-34b，负调控PAK5同源蛋白PAK1和ABCB1的表达，从而逆转骨肉瘤化疗耐药的分子机制。