犬小孢子菌膜蛋白PQ-LRP基因全长cDNA的克隆及功能分析

课题“犬小孢子菌膜蛋白PQ-LRP基因全长cDNA的克隆及功能分析”为国家自然基金资助项目（编号81071330），历经3年（2011-2013）已按原计划顺利圆满地完成预定任务，取得如下成果：.1．成功克隆了犬小孢子菌膜蛋白PQ-LRP基因全长cDNA:获得PQ-LRP基因序列全长1522bp，用ORF finder 分析，含有一个从50bp-1129bp长为1080bp的开放阅读框，编码359个氨基酸，并且得到5'端非编码区49bp，3'端非编码区393bp。已提交至GenBank（JF767222）。.2．成功构建并鉴定了犬小孢子菌PQ-LRP基因RNA干扰载体：(1)成功构建了RNA干扰载体pCB309-PLULT：将LPR正向干扰序列600bp连接到pUC-PUT载体的Ptrpc启动子和间隔序列之间，得到载体pUC-PLUT载体。将LPR反向干扰序列600bp连接到pUC-PLUT载体的间隔序列和Ttrpc终止子之间，得到载体pUC-PLULT。将pUC-PLULT上的PLULT片段（3.4 kb）通过酶切，与pCB309 (5.4 kb)连接，得到了载体pCB309-PLULT。( 2)将pCB309-PLULT质粒用电转化的方法转到根癌农杆菌EHA105中，完成了pCB309-PLULT质粒的根癌农杆菌转化。.3．用Real Time PCR法对犬小孢子菌PQ-LRP基因干扰前后的mRNA相对表达量的分析：干扰后PQ-LRP基因表达水平较干扰前下调61%。.4．犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默后对形态的影响：(1)菌落：干扰后气中菌丝减少，色素变浅。(2)显微镜下：干扰后大分生孢子弯曲、细长、分隔不规律。(3)超微结构：扫描电镜：大小分生孢子干扰后弯曲、皱缩、甚至破壁，菌丝不饱满。透射电镜：大分生孢子干扰后细胞壁增厚、壁破、细胞核及细胞器减少。.5．建立了犬小孢子菌PQ-LRP基因干扰前后致豚鼠感染模型：(1)模型特征：干扰株较野生株红斑小，炎症轻。(2)致病豚鼠真菌镜检：野生株与干扰株均可见发内外孢子，不同的是干扰株孢子量少，菌丝粗细不一。.6．半胱氨酸对犬小孢子菌PQ-LRP基因干扰前后的mRNA相对表达量的分析：干扰前随半胱氨酸的浓度增加PQ-LRP基因表达水平上调明显，干扰后PQ-LRP基因表达变化不明显。.7．已发表相关论文4篇