多发性硬化症NK细胞对自身T淋巴细胞的细胞毒性作用及其分子机制

NK在多发性硬化症等自身免疫性疾病中发挥着得要的免疫调节作用。为了阐明NK细胞对自身T淋巴细胞的杀伤作用及其可能的机制，我们开展了本研究，研究结果如下：.1. 明确了NK细胞对自身T淋巴细胞具有抑制或杀伤作用。应用BrdU掺入法及CFSE染色检测了PBMC中NK细胞对自身T淋巴细胞增殖的影响，结果显示NK细胞对T淋巴细胞的增殖具有抑制作用；利用分离的NK细胞及T淋巴细胞并进行了杀伤试验并进行了杀伤条件的优化，结果表明NK细胞对自身T淋巴细胞具有杀伤作用，随着杀伤时间的延长，杀伤率越高，且NK细胞只杀伤激活的T淋巴细胞胞，而对未激活的T淋巴细胞没有杀伤能力。.2. 明确了NK细胞是以颗粒释放方式杀伤自身T淋巴细胞。根据NK细胞杀伤靶细胞两种作用机制的特点，我们选择不同的阻断剂，利用建立的流式细胞仪检测细胞杀伤作用的实验方法，研究不同阻断剂对NK细胞杀伤自身T淋巴细胞的阻断效果。结果表明，NK细胞主要通过颗粒释放的方式杀伤自身T淋巴细胞。.3. 明确了颗粒酶K在NK杀伤自身T淋巴细胞中的发挥主要作用。利用荧光标记的抗人颗粒酶A，B或K的抗体对共培养的NK细胞和T淋巴细胞进行细胞内染色，通过流式细胞仪检测T淋巴细胞中颗粒酶的水平，结果表明，更多的颗粒酶K从NK细胞释放到T淋巴细胞中，而颗粒酶A和颗粒酶B转移的比较少；根据颗酶A，B或K的不同作用机制，利用流式细胞仪检测Caspase-3的激活及线粒体中ROS的产生和线粒体电势下降的情况，结果显示T淋巴细胞中的Caspase-3并没有明显被激活，但ROS的产生增加和线粒体膜电位下降，表明颗粒酶B没有发挥主要作用；进一步利用RNA干扰实验最终确定颗粒酶K在NK细胞杀伤自身T淋巴细胞中发挥主要作用。.4. 明确了EAE小鼠的NK细胞对自身T淋巴细胞的杀伤能力要低于正常小鼠的NK细胞。利用MOG35-55免疫小鼠制备EAE小鼠模型，分离EAE小鼠和正常小鼠的NK细胞和T淋巴细胞并进行共培养，从杀伤率、ROS产生及颗粒酶转移实验均表明EAE小鼠NK细胞对自身T淋巴细胞的杀伤能力显著低于正常小鼠的NK细胞。该研究结果进一步从EAE疾病模型动物证明了NK细胞对自身T淋巴细胞的杀伤作用及其机制。