Anti-HBs-CD3-BiTE构建的优化及其启动抗HBV特异性T细胞免疫研究
批准号：
82070610
项目类别：
面上项目
资助金额：
55.0 万元
负责人：
潘孝本
依托单位：
学科分类：
炎性及感染性肝病
结题年份：
2024
批准年份：
2020
项目状态：
已结题
项目参与者：
潘孝本
项目摘要
结项摘要
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中文摘要
HBV特异性T细胞免疫耗竭是乙肝慢性化的关键环节和实现功能性治愈的主要障碍。本项目拟设计靶向HBsAg和T细胞CD3ε分子的双特异性T细胞衔接子（BiTE）以充分启动靶向HBV感染肝细胞的T细胞免疫。基于既往前期工作基础，拟进行4种BiTE的结构设计和优化：包括经典BiTE，基于肽核酸(PNA)组装的PNA-BiTE、基于生物素-链霉亲和素组装的BS-BiTE，及纳米BiTE的设计。拟通过基因表达或多肽合成生产相应BiTE，以支持HBV稳定复制的HepAD38细胞系/HBV感染HepG2-hNTCP细胞和T细胞共培养为细胞模型，以人源化CD3分子的C57BL/6J-CD3eem1(hCD3E)Smoc转基因小鼠注射AAV-HBV1.3为慢性HBV复制动物模型，评价和优化BiTE的功能和设计。本项目为解决HBV特异性免疫细胞耗竭，实现慢乙肝功能性治愈提供研究基础，并拓展BiTE的设计策略。
英文摘要
HBV-specific T cell immune exhaustion is a key mechanism of chronic hepatitis B and a major obstacle to achieve the functional cure. This project intends to design a bispecific T cell engager (BiTE) that targets HBsAg and T cell CD3ε molecules to initiate T cell immunity targeting HBV-infected liver cells. Based on our previous work, we will conduct the structure design and optimization for 4 types of BiTE including: classic BiTE, PNA-BiTE based on peptide nucleic acid (PNA) assembly, BS-BiTE based on biotin-streptavidin assembly, and nanobody BiTE. We will produce the BiTEs through gene expression or peptide synthesis. Co-cultures of HepAD38 cell line supporting the stable HBV replication/ HepG2-hNTCP cell line supporting HBV infection, and T cells are used as the cell culture models. C57BL/6J-CD3eem1(hCD3E)Smoc mice with PAAV-HBV1.3 injection are used as HBV replication animal models to evaluate and optimize the function and design of BiTE. This project will provide research basis for treatment of HBV-specific immune exhaustion and achieving functional cure of chronic hepatitis B, and will expand the design strategy of BiTE.
HBV感染仍是全球公共卫生问题，其可导致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。目前已批准应用于临床治疗的药物主要是干扰素和核苷（酸）类似物，但这些药物仅可使约1/3患者达到部分治愈，多数患者停药后病毒反弹。实现持续的HBV DNA抑制和HBsAg转阴，即功能性治愈是慢乙肝治疗的理想目标。HBV特异性T细胞免疫耗竭是乙肝感染慢性化发生机制和实验功能性治愈的关键环节。本项目设计了靶向HBsAg和T细胞hCD3ε分子的双特异性T细胞衔接子（BiTE），以通过T细胞与HBV感染细胞的空间高度接近来启动特异性T细胞免疫。课题组设计了18种不同组合的Anti-HBs-CD3-BiTEs，使用AI进行了蛋白结构模拟和优化，并对优化后的BiTE进行了质粒构建和蛋白表达。基于HBV稳定复制的HepG2.2.15细胞系及HBV DNA转染的HepG2细胞和PBMC共培养的细胞模型，以及C57BL转基因小鼠注射AAV-HBV1.3为慢性HBV复制动物模型，我们对上述各种BiTEs进行了评价和优化设计。研究结果：1、通过序列筛选和结构组合，ELISA及免疫荧光染色等实验，鉴定了优化的双特异性抗体分子XTL19-UCHT1，其对HBsAg及CD3分子均具有高效特异性结合能力。2、优选的BiTE分子处理健康人PBMC，显示其具有激活免疫细胞的能力。3、通过HBV 复制细胞与PBMC细胞共培养实验，证明XTL19-UCHT1 BiTE可诱导T细胞发挥抗HBV功能。4、在CD3人源化转基因小鼠动物模型实验中，水动力注射BiTE在HBV AAV转染的小鼠中展现抗HBV复制能力。5、基于上述结果，我们以此为基础构建了Nanobody-anti-HBs-CD3-BiTE分子及双特异性化学小分子的构建，此部分研究尚在进展中。在整个项目实验过程中，课题组已发表英文论文6篇，已授权国家发明专利1项。主要研究内容纳入到研究生毕业论文中，培养毕业硕士研究生3人，共同培养博士研究生1人，硕士研究生2人，在站博士后1人。投稿接收或参加了4次国际会议，3次国内会议。虽然基于研究结果和最近国内外进展，我们项目进行了一些及时及必要的调整。总体而言，本项目如计划实施，研究结果为解决HBV特异性免疫细胞耗竭，实现慢乙肝功能性治愈提供研究基础。
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