Streptomyces Avermitilis NEAU1069生物合成多拉菌素（Doramectin）基因簇克隆和关键基因功能分析

按计划完成项目的预期研究计划和目标。. 为了提高新菌株S. avermitilis neau 1069生物合成多拉菌素的单位产量，揭示与国外阿维链霉菌菌株代谢多拉菌素特性的差异。诱变、合理选育获得了在50 L罐发酵中产多拉菌素单位产量稳定在870±58 mg/ml的高产菌株，表现出了良好的产多拉菌素潜能。克隆S. avermitilis neau 1069生物合成多拉菌素基因簇，全长为144.5 kb，而国外报道的S. avermitilis基因簇全长仅82 kb，且一些相同功能基因的位置不同。S. avermitilis neau 1069生物合成多拉菌素基因簇中起始单元AT基因与国外报道生产用的野生菌株S. avermitilis ATCC31272的蛋白一致性仅为82%，可能是S. avermitilis neau1069菌株多的生物合成多拉菌素的重要原因。定量RT-PCR分析在菌体生长过程中阿维菌素生物合成前体二甲基丁酸、异丁酸的关键酶α-酮酸脱氢酶（BCDH）基因转录水平，发现S. avermitilis neau 1069中该基因的转录水平始终低于S. avermitilis ATCC 31272七倍以上，这是S. avermitilis neau 1069少的生物合成阿维菌素特性的缘故。而两个菌株生物合成基因簇中的调控dorC基因与aveC基因的关键核苷酸差异，是S. avermitilis neau1069生物合成与多拉菌素结构仅在C25位有差异，在提取纯化过程中极难分离的杂质CHC-B2较多的重要原因。点突变S. avermitilis neau 1069生物合成多拉菌素基因簇中的dorC基因，明确了不同dorC基因序列影响多拉菌素与CHC-B2生物合成比例。定点突变dorC基因中11个氨基酸残基并同源重组，获得了极少生物合成杂质CHC-B2的优良、高产基因工程菌，发酵单位产量稳定在3700mg/ml以上，比野生菌株的9 mg/ml提高411倍。突破了国内外的菌株因多拉菌素单位产量少，而生物合成在生产中极难分离除去的阿维菌素、CHC-B2多，不易工业化生产的关键技术。. 发表SCI论文4篇。