西双版纳红色原鸡IFN-γ基因多态性分布及其对禽流感和新城疫免疫效果的影响

项目组在自主设计出能高度特异扩增红色原鸡IFN-γ cDNA的克隆用引物及荧光PCR引物，并对PBMC体外培养物的ConA或特异性病毒抗原刺激浓度及诱导表达时间进行优化的基础上，对收集自滇南的62只健康红色原鸡接种NDV与HPAIV（Re-5株）灭活苗，采用HI试验测定免疫前及再次免疫后的血清HI抗体效价，采用荧光定量PCR（qPCR）技术测定ConA诱导PBMC培养物的IFN-γ mRNA表达水平，采用ELISA测定特异性病毒抗原回忆性诱导PBMC培养物的IFN-γ蛋白表达水平；采用PCR+1技术分别扩增及克隆IFN-γ启动子区域（n=62）和编码区（n=34），经对重组质粒DNA双向测序，结合应用DNAStar软件进行序列比对及与现有家鸡资料比较，确定IFN-γ SNP位点、数量及类型；最后采用SAS软件GLM过程对频率观测值高于5的SNP基因型与相应HI抗体效价进行最小二乘均值关联分析。结果发现，实验原鸡群体免疫前血清HPAIV抗体效价均为零，但有23只原鸡NDV抗体呈阳性，再次免疫后二者效价均有不同程度升高；ELISA测定未经抗原刺激的PBMC对照组误差较大，故相关结果暂不予采纳；qPCR检测发现34只原鸡PBMC在相同诱导条件下IFN-γ mRNA表达水平存在较大差异；在原鸡IFN-γ编码区和启动子区域分别检测到19和140个SNP位点（含+2133 A→T引起Glu→Val），其中-316A/G SNP频率最高；针对HPAIV，-316AA基因型的HI抗体效价（n=32，8.00±0.252 log2）显著高于GG基因型（n=7，6.57±0.539 log2）（P=0.0196<0.05），AG基因型的抗体效价（n=23，7.74±0.298 log2）也高于GG基因型，但差异不显著（P=0.0629）。研究结果表明，红色原鸡IFN-γ SNP明显较家鸡丰富，且启动子SNP明显较编码区丰富；首次在原鸡属IFN-γ编码区发现存在一个导致错义突变的SNP；-316A/G SNP基因型与HPAIV抗体应答水平存在关联性，即携带-316A等位基因的原鸡个体可能较GG基因型纯合子对HPAIV的抗病力强，这对发掘利用该野生鸡种质资源、增强疫苗效力和协助抗病育种可能有一定参考意义。通过开展本基金项目工作，已支持2名硕士研究生完成毕业论文并在中文核心期刊发表文章3篇。