新单抗ZCH-6-3A4靶向清除髓系白血病干细胞的实验研究

本研究获得如下研究结果：.1、3A4单抗较进口CD45RA单抗（L48）具有更强的识别活性，3A4能识别86%-100%的AML-LSC；3A4与复发难治白血病病人样本呈强阳性，阳性率为（96.96±3.74）%，明显高于L48（71.04±26.01）%（P=0.016）。.2、纯化3A4抗体对AML细胞株KG1a无CDC作用，但具有良好的ADCC作用。.3、NCTD-3A4免疫毒素在体外能有效杀伤KG1a细胞，96h 37C 孵育后杀伤率为61.09%，而对3A4阴性的Nalm-6细胞的杀伤率仅为3.56%。 .4、采用组织芯片技术和免疫组织化学染色检查发现，3A4单抗除识别淋巴结、小肠、脾脏、骨髓等造血组织细胞外，与所有其他正常组织细胞不反应。.5、用KG1a细胞株尾静脉注射接种NOD/SCID小鼠，成功建立了白血病动物模型，该模型组小鼠（3只）分别在30、40和51天内发病死亡，而NCTD-3A4治疗组分别于接种后122天才死亡，无NCTD偶联的3A4裸抗体进行治疗时，模型鼠分别于139、150、159天内死亡，生存时间明显长于无治疗模型组和NCTD-3A4免疫毒素治疗组小鼠。病鼠脱臼致死后病理检查发现，脑膜及外周血中存在大量白血病细胞浸润。 .6、 成功构建并表达3A4单链抗体ScFv3A4，通过构建3A4单链抗体-绿色荧光蛋白（ScFv3A4-EGFP）的方法对3A4抗体内化后细胞内的时相定位规律进行观察，发现37C 孵育0.5h开始内化，3h达高峰，内化率达72.64%。ScFv3A4-EGFP内化后迅速进入溶酶体，56h后在溶酶体中彻底降解。经ScFv3A4-EGFP真核表达载体转染CHO细胞后抗体产生的时相定位研究发现，融合抗体蛋白在内质网中大量合成，并通过高尔基体分泌至细胞外上清中。 .7、通过构建CD45抗原多个剪接体真核表达载体和瞬时表达的方法建立转染子细胞，并通过流式细胞术检测3A4抗体所识别的抗原表位，发现3A4抗体所识别的抗原表位为CD45RC。 . 综上所述，自制新单抗3A4具有良好的识别AML-LSC及子代白血病细胞的作用，在体内外均具有良好的靶向杀伤/治疗作用。机制主要通过ADCC及内化免疫毒素NCTD发挥杀伤靶细胞和AML-LSC的作用。为进一步开发该抗体药物奠定了坚实的实验基础。