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乙烯基醚/Oxadiazinone的生物正交化学用于新生RNA标记的研究
结题报告
批准号：
21807005
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
25.0 万元
负责人：
闫宁
依托单位：
北京大学
学科分类：
B0702.生物分子的化学生物学
结题年份：
2021
批准年份：
2018
项目状态：
已结题
项目参与者：
阿木古布、苏文博、王忠宇、张雪莉
关键词：
新生RNA生物正交化学RNA相互作用组核苷修饰活细胞标记
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中文摘要
RNA是细胞内的重要功能组份，其参与基因转录、翻译、RNA干扰、核酶催化等一系列的重要生物学过程。本课题拟设计并合成一系列乙烯基醚修饰的核苷类似物，使其能够代谢掺入新生RNA。同时发展一种新的基于乙烯基醚/Oxidiazinoe的生物正交Inverse Diels-Alder反应，将其用于新生RNA的荧光标记。在不影响RNA正常功能的条件下实时观察RNA的合成、时空分布以及动态变化，并获得新转录RNA的相互作用蛋白质组信息。探讨不同的疾病发生发展过程以及药物处理时细胞中RNA的表达及动态变化，从而为各种生物学研究提供关键信息。
英文摘要
RNA is an important functional component in cell, which is involved in a series of important biological processes such as gene transcription, translation, RNA interference, and ribozyme catalysis. We intends to design and synthesize a series of vinyl ether modified nucleoside analogues, which can be metabolically incorporated into nascent RNA. Meanwhile, a new biorthogonal Inverse Diels-Alder reaction based on vinyl ether/oxadiazinone was developed and used for fluorescent labeling of nascent RNA. Without disturbing the normal function of RNA, monitoring of RNA synthesis, temporal and spatial distribution, and dynamics, obtaining the information of newly-transcribed RNA interactome. Explore the RNA expression and dynamics in cells under various diseases progression and during various drug treatment, so as to provide key information for various biological research.
检测RNA的分布、动态及周转可以为基因转录调控、信号通路研究、药物作用机制、个体发育与疾病的发生发展等一系列重要的生物学研究提供关键的信息。当前已有的检测新生RNA的方法只有叠氮/炔基点击化学的方法和烯烃/四嗪点击化学的方法。叠氮/炔基点击化学的方法需要在标记时需要Cu(I)的存在，这会造成RNA的降解，从而影响结果的准确性。叠氮基团难以掺入新生的RNA，已报道的方法需要将核苷制备成三磷酸形式或者突变尿苷-胞苷激酶，这都极大的限制了该方法的应用。烯烃/四嗪点击化学的方法使用5-VU，由于烯烃和吸电子碱基共轭，这使得该反应的速率很慢，从而大大的降低了标记效率。另外，这些方法都无法用于活细胞内新生RNA的标记。因此，发展一种能够活体原位检测新生RNA的方法具有极为重要的意义。.我们利用醌亚甲基化合物和富电子烯烃的[4+2]环加成反应，发展了一种新的标记新生RNA的方法。氮活化苯乙烯与细胞内源性物质不发生反应，且氮活化苯乙烯未发生类似烯胺的水解。氮活化苯乙烯和四嗪的反应是生物正交成键反应，二级反应速率常数为1.262 M-1S-1。这与四嗪和降冰片烯1.9 M-1S-1，四嗪和环丙烯2.3 M-1S-1的二级反应速率常数相当，优于环张力炔烃和叠氮的生物正交反应(SPAAC) 10-2~1 M-1S-1。我们使用氮活化苯乙烯 (TAMRA-linker-哌嗪苯乙烯) 和巴比妥酸核苷用于细胞内新生RNA的标记 ，结果表明标记组细胞和对照组细胞具有明显的差异。再结合DNA合成抑制剂羟基脲(Hydroxyurea)、 DNA聚合酶抑制剂阿非迪霉素(aphidicolin)以及DNA聚合酶抑制剂放线菌素D (actinomycin D)处理组的实验结果，我们的方法可以特异性的标记细胞内新生RNA。.另外，我们设计了异腈和四嗪的[4+1]环加成反应用于用于标记新生RNA，当前已完成异腈修饰的核苷5-异腈亚甲基尿苷和N4-异腈胞苷的合成，也完成了四嗪淬灭的荧光染料Tz-Ph-BODIPY的合成，当前正在优化细胞内新生RNA的标记条件。.最后，我们设计了基于代谢核酸模板反应来标记特定序列的新生RNA的方法，完成了修饰核苷2’O-VU以及检测NADPH的探针NADPH-N3Ap和检测28s rRNA的探针28s rRNA-2’OVUp的合成，当前正在优化细胞标记条件。
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