大肠杆菌K5产肝素前体heparosan代谢控制研究

Heparosan是大肠杆菌K5的细胞荚膜多糖，因其分子结构与硫酸乙酰肝素和肝素有类似多糖骨架结构，可以作为人工合成生物工程肝素的前体。因此，大肠杆菌K5发酵产生的heparosan有很好的应用前景。提高肝素前体heparosan的产量及其分子量分布的控制是进行人工肝素酶法合成的前提。本研究进行了大肠杆菌K5合成heparosan基因簇中单个或多个关键酶基因的克隆和过量表达研究, 利用实验室自行表达制备的heparinase II处理K5荚膜可以提高外源基因的转化效率。但原位过量表达尚未实现。发现部分环境因子的胁迫可以促进heparosan的产量，如，K5能够耐受适量的蛋氨酸和甘氨酸的加入及SnCl2和有机溶剂（酒精和甲酰胺）的胁迫，并且其heparosan产量均有增加。而且我们构建的一株工程菌株 E. coli KT (K5的 waaR 基因敲除菌株) 也显示同样的效果。在发酵条件和发酵罐补料工艺研究中，建立了一种酶法定量heparosan的新方法。发现发酵罐搅拌桨转速对heparosan产量和分子量分布没有显著影响，但不同培养基和培养工艺，不同发酵时间发酵液中heparosan分子量分布有明显差异。发现控制糖链延长相关基因WaaR敲除，对糖链产量及其分子量分布也有一定影响。一些物理化学方法均能解聚heparosan获得不同分子量分布的产物，但发现产物结构上的变化。HeparinaseⅠ以及HeparinaseⅡ、Ⅲ的解聚效果更好。酶法解聚不仅可以通过解聚条件的控制，获得期望的分子量分布来制备肝素。同样可以利用肝素酶解聚来先期获得低分子量heparosan，再来直接制备低分子量生物工程肝素。这些结果为大规模生产heparosan用于制备人工肝素和以heparosan为结构基础新型生化药物的开发打下基础。