湘蕾系列忍冬MADS-box基因的克隆与功能分析

中文摘要：研究分五部分进行，采用了denovo转录组测序、RT-PCR、RACE、qRT-PCR、转基因等技术。第一部分，灰毡毛忍冬自然突变株（湘蕾系列），其叶的外部形态、叶片横切面显微构造、叶柄横切面显微构造与常规株基本相似，但叶片下表皮气孔数及气孔指数存在较大差别，灰毡毛忍冬自然突变株叶片特征较常规株发生了改变，可作为两者鉴别特征，为花、茎、叶采集提供实验依据；第二部分，SDS法均不适用于茎、叶、花总RNA的提取；对于叶，Trizol法提取效果最佳；对于茎，改良CTAB法提取效果最佳；对于花蕾，多糖多酚试剂盒法提取效果更佳，以上三种方法提取的对应样品总RNA完整性好，纯度高，能满足全长基因克隆等后续实验要求； 第三部分，应用Solexa高通量测序技术对灰毡毛忍冬常规品种和湘蕾品种花样品进行转录组de novo测序分析，获得了海量功能明确、具有自主知识产权的灰毡毛忍冬基因序列，为灰毡毛忍冬的深入研究提供了大量数据，获得总Unigene基因67,222条，其中两品种具有明显表达差异的Unigene基因共20,709条。通过注释统计分析，其中对花器官形成发育具有重要调控功能且具有表达差异的MADS-box家族基因的Unigene基因共24条，为后续湘蕾金银花特殊表型的研究提供了有力的参考价值；第四部分，利用RACE技术首次克隆了灰毡毛忍冬MADS-box家族基因全长、核心片段和5’片段或3’片段。现已经克隆出常规株和湘蕾株AGL15，AP1和TM6的核心片段，AGL15全长及AP1基因5’序列，它们均为首次从灰毡毛忍冬中报道的全长或部分片段序列。利用qRT-PCR技术筛选出的灰毡毛忍冬最适内参基因为18SrRNA ，并进行了差异基因AGL15的表达分析。AGL15在灰毡毛忍冬花、茎、叶各器官均有表达，其中花蕾中表达最高，叶片次之、茎中最低，其在湘蕾型灰毡毛忍冬植株表达量远高于同期常规型灰毡毛忍冬花蕾中的表达量，且花中AGL15表达量随花期进程而逐渐降低，提示该基因与花发育相关。第五部分， AGL15转拟南芥成功，转AGL15拟南芥植株较野生型拟南芥植株花期推迟，提示AGL15基因功能可能为延缓植物开花，具体功能需进一步研究验证。项目研究中，发表论文4篇，2篇收录，参加国际培训会议1次，国内会议培训3次，培养硕士研究生3名，博士研究生1名，获科研奖励1项。