沙眼衣原体pORF5蛋白功能及其与宿主细胞相互作用的研究

pORF5是申请者在国际上首次发现由沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, Ct）质粒蛋白基因编码并分泌到宿主细胞胞浆的一种分泌性蛋白。为阐明pORF5蛋白功能并鉴定其是否与宿主细胞蛋白发生相互作用，本研究采用分子生物学技术构建了pDSRed-C1/pORF5真核表达重组体，建立了pORF5基因转染的HeLa-229细胞转染株，发现转pORF5基因胞浆表达pORF5不会影响Ct感染率；采用杂交瘤技术制备pORF5抗体，共获得了6株抗体分泌稳定的杂交瘤细胞株（2h4、5e5、10g4、2d12、4e6、9c8）；构建了pGEX-6p/pORF5原核表达重组体，制备了高纯度可溶性的pORF5融合蛋白，融合蛋白经蛋白酶酶切后制备了不含GST标签的pORF5蛋白，将纯化的pORF5蛋白体外刺激细胞，采用细胞生物学技术分析pORF5蛋白对细胞的影响，结果发现：pORF5蛋白能激活宿主细胞p38/MAPK、ERK/MAPK通路，并诱导宿主细胞产生IL-8、IL-1β 和 TNF-α等前炎症因子，同时证实pORF5蛋白通过激活宿主细胞模式识别受体TLR2诱导IL-8、IL-1β 和 TNF-α等前炎症因子的产生；进一步将纯化的pORF5蛋白接种于小鼠阴道后穹窿，体内实验发现pORF5蛋白能引起小鼠输卵管肿胀，生殖道局部增殖有大量的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、浆细胞及巨噬细胞等炎性细胞浸润，炎症病理积分明显高于对照组，血清及阴道分泌物中存在较高水平的TNF-α、IL-1β、IL-6等前炎症因子。提示pORF5蛋白在Ct泌尿生殖道持续性感染的过程中可能发挥重要作用。本项目的研究可为衣原体疾病的预防、诊断和治疗提供重要的理论和实验依据。