解毒通络法抑制脑缺血小胶质细胞活化损伤血脑屏障的研究

缺血再灌注引发的炎症反应是BBB损伤的核心环节之一，小胶质细胞被认为是首先对应激作出反应的脑细胞，阻止小胶质细胞的活化可能限制BBB破坏，减少向水肿和出血的转化。对小胶质细胞的活化调节及其对BBB作用机制的研究成为当前防治中风的新思路。.本课题主要采用细胞培养技术，建立小胶质细胞（小鼠BV2细胞）与BBB体外模型（balb/c小鼠脑微血管内皮细胞）共培养的研究方法，结合大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，通过免疫组化、分子生物学、ELISA等方法从体内外两方面综合分析与小胶质细胞活化相关的活性氧、NADPH氧化酶及P38MAPK信号转导通路的变化，以及血脑屏障功能蛋白的表达。 结果表明：.（1）大鼠MCAO模型缺血24小时开始小胶质细胞活化持续到48小时，同时伴有血脑屏障功能的破坏。.（2）清开灵注射液能够有效地调控小胶质细胞的过度活化，降低大鼠脑缺血后COX-2、gp91phox的表达并增加紧密连接蛋白ZO-1的表达，保护BBB完整性,减小梗死面积，保护脑组织。.（3）使用三气培养箱来模拟体内缺氧环境，缺氧（1.0％O2，无血清的DMEM培养基）24h再复氧（5％CO2，DMEM）24h的方法建立体外模拟脑缺血再灌注损伤的小胶质细胞与BBB的共培养模型。.（4）小胶质细胞缺氧模型中，细胞上清液中炎症因子TNF-α表达明显增加，清开灵和米诺环素有明显的降低作用。清开灵注射液在抑制COX-2、iNOS和gp91phox基因和蛋白的表达发挥抑制炎症和氧化应激作用的同时，通过拮抗p38信号转导通路活化抑制小胶质细胞活化。.（5）在条件培养液模型中，BV2小胶质细胞缺氧上清液对balb/c内皮细胞活性有明显降低作用，内皮细胞培养液中NO表达明显增加，清开灵注射液小、中、高浓度及米诺环素组可以通过抑制小胶质细胞活化提BBB高内皮细胞活性。.（6）采用millicell hanging Cell Culture Inserts共培养小胶质细胞和内皮细胞，BV2细胞缺氧24小时后与内皮细胞共培养24小时，可建立体外小胶质细胞活化损伤BBB模型。.(7) 共培养模型中，小胶质细胞缺氧再复氧后活性氧表达明显增加，并通过TLR4-ROS-TJs损伤血脑屏障功能，清开灵通过调控小胶质细胞活化降低TLR4及gp91phox蛋白表达，增加内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1起到保护BBB的作用。