多功效靶向重组益生素模式菌优化构建和深入研究

猪产肠毒素大肠杆菌ETECF18和K88菌毛完整黏附素操纵子编码基因在申请者实验室克隆和序列鉴定，进而靶向F18ab和K88ac优势血清型代表株的完整菌毛黏附素，运用DNA重组技术将上述两种菌毛操纵子编码基因分别克隆入广谱性CRIM质粒pCAH63（条件性复制、整合和调节性质粒），使之在CC118λpir工程菌中功能性表达F18和K88菌毛黏附素，同107/86和C83902亲本标准株一样，上述重组菌分别能与兔抗F18ab菌毛单因子血清和鼠抗K88ac菌毛单克隆抗体产生明显的凝集反应，且在体外均能较好地黏附于易感仔猪小肠上皮细胞。基于噬菌体位点特异性重组酶重组技术原理，探索重组技术路线和建立整合条件参数，将功能性表达上述菌毛黏附素的CRIM重组质粒整合到靶定的益生素大肠杆菌Nissle1917染色体特定噬菌体附着位点，使其最终成为单拷贝稳定性表达功能性F18和K88菌毛黏附素的整合体，进一步测试验证其同样能与易感仔猪肠上皮细胞良好的结合、黏附性能。鉴于Nissle1917中含有pMUT1、pMUT2两个隐秘大质粒和其质粒背景相对清晰的前提条件，引入自杀性载体并构建含上述待去除质粒的重组自杀质粒载体，利用质粒不相容性原理，去除菌内原有质粒并同步实施自杀质粒自身去除的特性，确保原有宿主菌内质粒完全去除，从而大大提高宿主菌Nissle1917的固有载荷能力而不影响其基因组和自身生物学特性性状，从而优化和简便Nissle1917染色体特定噬菌体附着位点整合技术条件、整合效率。因此，基于F18和K88操纵子基因稳定性整合在修饰完善的通用型载体模式菌Nissle1917中，能功能性表达菌毛黏附素并与易感宿主肠上皮细胞的结合、黏附特性，为遗传稳定、定植力强的多功效靶向重组益生菌。上述研究旨在靶向仔猪体内肠道上定居和有效持续表达黏附素，优先封闭和阻止肠道上皮细胞受体与ETEC病原菌的结合，开辟出非抗生素治疗、高效广谱、直接全新的细菌性治疗策略和预防途径。在平行试验中，将筛选标记gfp基因克隆入pCAH63中，筛选出用于整合的CRIM-gfp (p63GFP)质粒，通过λ噬菌体特异性整合位点将其整合入大肠杆菌工程菌SE5000基因组中。通过荧光显微镜可以检测到SE5000::p63GFP整合体中gfp基因的表达，为整合外源操纵子基因的表达和检测提供较为直观的筛选标记。