高氧致肺损伤新生鼠Occludin蛋白开放肺上皮屏障及其调控机制的研究

支气管肺发育不良（BPD）是早产儿常见的合并症之一，虽病因复杂，但早期肺水肿的病理变化已被证实，有关其发生机制目前多认为与氧化应激反应、炎症因子所介导的肺毛细血管通透性增强有关。本项目在前期工作基础上，通过研究肺上皮细胞紧密连接（TJ）结构及功能的改变，揭示BPD早期肺水肿的分子调控机制。建立BPD动物模型、原代培养新生鼠AT-Ⅱ细胞及制备体外肺上皮屏障模型，利用Western blot及Real time-PCR技术，测定肺组织及AT-Ⅱ的TJ相关蛋白及基因表达，通过免疫荧光技术观察肺上皮ZO-1、Occludin蛋白定位，利用透射电镜观察肺上皮屏障TJ的结构改变，通过跨上皮电阻观察肺上皮的通透性改变，发现肺上皮屏障开放是BPD早期肺水肿的关键环节，并进一步验证TJ相关蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-4表达均下调，但闭合小环蛋白ZO-1最明显，其次是咬合蛋白Occludin，表明ZO-1、Occludin表达下调所介导的TJ结构破坏和功能改变，是导致肺上皮屏障开放的重要机制。在建立体外肺上皮屏障模型的基础上，采用MMP9抑制剂GM6001体外干预肺上皮细胞，进一步阐明了过度表达MMP-9破坏了TJ的结构和功能，拮抗MMP-9后，可以上调ZO-1表达，逆转TJ的结构和功能改变。在动物整体及细胞水平，利用Western blot、Real time-PCR及免疫荧光等分子生物学技术，同步验证了BPD发生中，存在Caveolin-1基因及蛋白的表达下调，但其表达减少的发生要先于TJ相关蛋白，并通过构建Caveolin-1基因低表达和过表达细胞模型，进一步验证，上调小窝蛋白Caveolin-1，明显改善肺上皮紧密连接结构破坏及功能失常。因此，本项目不仅率先提出肺上皮屏障开放是BPD早期肺水肿的关键环节，并从新的角度揭示了其发生的分子调控机制，为临床有关BPD的有效防治途径的重新设计奠定了实验基础。