家蚕细小病毒样病毒BmPLV-Z DNA聚合酶的功能研究

家蚕二分浓核病毒特异性地感染家蚕中肠细胞，该病毒由VD1和VD2两个单链DNA分子组成，其中VD1基因组中含有一个大的ORF4，序列比对结果预示VD1- ORF4编码的蛋白在病毒复制和增值过程中起着重要的作用，其具体功能未知。在本项目研究中，我们揭示了VD1- ORF4的转录起始位点和转录终止位点，制备了针对VD1- ORF4理论氨基酸序列不同抗原表位的三种多克隆抗体，进而揭示了VD1-ORF4在病毒感染的家蚕中肠组织中编码多个蛋白，其中证实了VD1- ORF4编码一个127 kDa的大蛋白和一个53 kDa的病毒结构蛋白；另外，还有几个蛋白有待于进一步证实；亚细胞定位和免疫组化实验结果表明VD1-ORF4编码的蛋白主要出现在病毒感染晚期，并且能够进入细胞核发挥作用，表明VD1- ORF4编码的蛋白可能参与了病毒复制与增值。构建了快速表达外源基因的真核表达系统，证实了VD1- ORF4在该表达系统中不表达或者表达量极低，由此表明VD1- ORF4编码的蛋白性质特异；同时利用该表达系统快速表达了家蚕二分浓核病毒NS1蛋白，对纯化到的NS1蛋白进行质谱分析，发现该蛋白第191位苏氨酸位点残基上发生磷酸化修饰；ns1基因启动子活性研究结果表明：-236 nt到-206 nt间的30 个核苷酸序列是ns1启动子高活性的依赖序列，该启动子也是TATA-box非依赖性的启动子；构建了家蚕生物反应器快速表达家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的平台体系。Co-IP实验结果揭示了161多种家蚕蛋白以及病毒蛋白与VD1- ORF4蛋白间发生相互作用，其具体作用有待下一步研究。