温敏型水凝胶生物支架负载Lingo-1 shRNA促进脊髓损伤修复的研究

LINGO-1是一种中枢神经系统的特有蛋白,只表达于中枢神经系统神经元和少突胶质细胞。研究证实它是髓磷脂相关抑制因子信号复合体（NgR1信号复合体）发挥作用的重要功能组分,其胞质区第591位氨基酸残基的磷酸化是NgR1信号复合体发挥活性的基础,在髓磷脂抑制因子阻滞轴突再生的信号通路中起着关键作用。LINGO-1的发现为改善脊髓损伤后的抑制环境促进轴突再生提供了新的途径,即通过靶向抑制LINGO-1基因表达,阻滞NgR1/p75/LINGO-1及其下游信号的传导而促进轴突生长。本课题成功构建慢病毒载体介导LINGO-1-shRNA拮抗LINGO-1基因，在建立全横断脊髓损伤动物模型成功后，即刻体内拟采用温敏型水凝胶负载LINGO-1-shRNA协同修复脊髓损伤,使慢病毒LINGO-1-shRNA被水凝胶包裹而定位植入作用于损伤局部, 达到在水凝胶植入同时局部维LINGO-1-shRNA慢病毒有效转染浓度的要求,持续释放,有效将siRNA传递到目标细胞内，转染细胞。研究应用温敏型水凝胶生物支架负载递送LINGO-1-shRNA促进脊髓损伤神经修复的可行性和优越性，探讨LINGO-1-shRNA对轴突再生的影响和机制。结 果:动物模型脊髓损伤后，局部注射温敏型水凝胶生物支架负载递送LINGO-1-shRNA能够显著改善脊髓损伤后运动功能和脊髓诱发电位的恢复。通过免疫荧光检测显示水凝胶负载LINGO-1-shRNA能够显著提高损伤局部靶细胞的有效转染，RT-PCR 和Westrnblot检测显示能够明显减少损伤区域组织细胞LINGO-1及RhoA的基因表达水平，TUNEL染色显示损伤后细胞的凋亡水平明显被抑制，组织学染色(Nissl染色和HE染色)检测显示神经元存活明显增多及脊髓空洞面积减小。透射电镜、免疫荧光和Westrnblot检测显示水凝胶负载LINGO-1-shRNA能够显著促进损伤区域轴突的再生以及神经通路的发生，进而修补脊髓空洞面积。该课题证明生物支架负载 RNA干扰沉默特定基因促进脊髓损伤神经修复的可行性和优越性,有望解决在活体内局部应用 RNA 干扰 LINGO-1基因表达而促进轴突再生修复的难题,为脊髓损伤修复提供新的方法与思路。