PKC-δ/mTOR信号通路在哮喘气道重塑中的调控机制

为阐明PKC-δ/mTOR/HIF-1a/VEGF和PKC-δ/mTOR/NF-κB信号通路在哮喘气道炎症和气道重塑中的免疫调节机制，项目组圆满完成了4项计划研究内容，并进行了拓展研究。（1）在体内利用卵清白蛋白(OVA)制作哮喘小鼠模型，之后利用PKC-δ抑制剂Rottlerin、PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂Rapamycin、HIF-1a抑制剂2ME2、VEGF抑制剂CBO-P11不同途径给予小鼠治疗，用HE、PAS染色观察肺部炎症和气道粘液分泌，以及免疫组织化学染色观察肺组织Muc5AC、mTOR、VEGF蛋白的表达；用ELISA检测支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α、IL-1ß、Eotaxin、ICAM-1、VCAM-1 水平；用Western blot方法检测肺组织Muc5AC、CLCA3、IL-4、IL-5、IL-13、TNF-a、IL- 1ß、Eotaxin、ICAM-1、VCAM-1以及PKC-δ、PI3K、AKT、mTOR、HIF-1a、VEGF、NF-κB p65等蛋白的表达。最终阐明PKC-δ分别通过上调Pi3k/Akt/mTOR/HIF-1a/VEGF和mTOR/NF-κB信号通路加重支气管哮喘气道重塑；（2）在体外进行BEAS-2B 细胞培养，予以TNF-a/IL-4进行激发，之后利用siRNA-PKC-δ和siRNA-Con以及PKC-δ抑制剂Rottlerin进行干预，用Western blote方法检测肺组织PKC-δ、PI3K、AKT、mTOR、HIF-1a、VEGF等蛋白的表达。进一步证实和确认PKC-δ通过上调Pi3k/Akt/mTOR/HIF-1a/VEGF信号通路诱导细胞的活化；（3）建立支气管哮喘小鼠模型，给予抗IgE抗体、A20和Pyrin重组蛋白、雷帕霉素等免疫佐剂和Silibinin、桦褐孔菌多糖、黑米花色苷等天然药物的有效成分，通过检测支气管肺泡灌洗液的细胞分类及上清液中炎症细胞因子的含量、血清IgE含量、肺组织组化和免疫组化、Western blot等指标，确认这些物质抗哮喘作用及机制；（4）建立Anti-DNP IgE介导的肥大细胞过敏模型，给予cornuside、花青素等天然药物的有效成分, 通过检测组胺等炎症介质和PCA，阐明其抗过敏作用及机制。