DEAF1调控外周组织抗原基因表达机制的研究

DEAF1是一个重要的转录因子，在鼠胰淋巴结中调控着外周组织抗原（peripheral tissue antigen，PTA）基因的表达，其表达或功能异常与NOD小鼠糖尿病的发生密切相关。在胰淋巴结中异位表达的外周组织抗原可通过克隆清除诱导外周免疫耐受，是外周免疫耐受建立和维持的机制之一。本项目拟利用生物信息学，分子生物学及其它相关实验技术，探讨DEAF1调控外周组织抗原基因表达的分子机制。将小鼠DEAF1原核表达质粒转入E.coli，纯化诱导表达的重组蛋白，然后免疫BABL/c鼠以制备单克隆抗体和多克隆抗体。得到的多克隆抗体具有较高的特异性、敏感性和亲和力，可用于检测内源性表达的DEAF1。分析DEAF1 及其变构体在NOD小鼠和BABL/c鼠不同周龄、不同淋巴结中表达水平及变化，发现只有DEAF1的变构体在NOD小鼠胰淋巴结中的表达谱发生变化。将Deaf1全长cDNA插入真核表达载体，并将真核表达质粒导入293T细胞，建立稳定表达细胞株。收集足够的DEAF1稳定表达细胞，用抗Flag亲和珠子进行免疫沉淀，SDS-PAGE分离，切下富集的蛋白带做质谱分析。排除其中的假阳性和非核蛋白之后，一共获得17种候选蛋白质因子，对这些蛋白质因子做功能分类。克隆得到部分候选蛋白质因子的cDNA，分别插入真核表达载体，检测其表达，Co-IP验证其与DEAF1的相互作用。发现Cul-1和Hspa8可能存在于DEAF1的相互作用，但这个结果重复性较差。从受DEAF1调控的基因中挑选4个基因，分别是Dct、Ahsg、Sycn、Pcki，其中两个基因的启动子含DEAF1结合基序，两个不含DEAF1结合基序。克隆得到这4个基因的启动子序列，并插入pGL3-Basic质粒，构建带有不同启动子的报告基因质粒，将这些报告基因质粒与对照质粒分别转染DEAF1稳定表达细胞株，这些启动子可启动报告基因荧光素酶的表达，该系统将用于验证候选蛋白质因子与DEAF1的相互作用，验证工作还在进行中。.该研究项目的完成将明确DEAF1在淋巴结中调控PTA表达的分子机制，为外周免疫耐受的建立和维持机制的研究提供一些新的线索。