决定芥菜开花信号整合子命运的两个反式元件相互作用及其特异性介导结构域鉴定

Flowering Locus C（FLC）和SHOTR VEGETATIVE PHASE（SVP）是抑制芥菜（Brassica juncea）开花的两个核心转录因子，能够调节开花时间。在本室芥菜SVP与FLC体外原核蛋白表达和相互作用研究基础上，克隆了SVP和FLC基因，分析了其MIKC结构域等生物学信息；构建诱饵质粒pGBD-FLC与猎物质粒pGAD-SVP并转化酵母进行互作特性研究，载体互换重构质粒pGBD-SVP与pGAD-FLC并再次转化酵母验证，建立了基于SVP与FLC互作的酵母双杂体系。同时分别扩增含MIKC结构域的SVP全长编码区及多个含部分结构域的编码区并构建多个猎物质粒，与诱饵质粒pGBD-FLC酵母双杂，发现SVP依靠K域（含K1、K2和K3亚域）与FLC互作；再次构建FLC的多个突变体，与SVP酵母双杂发现FLC也依靠K域与SVP互作。进一步构建了K域亚域的多个突变体，并基于Gal4酵母双杂交系统和β-半乳糖苷酶活性分析了芥菜FLC与SVP异源互作以及FLC与FLC、SVP与SVP同源互作机制。发现SVP的K1亚域与FLC的K1亚域能异源蛋白互作；SVP的K2亚域可加强该作用，但L2连接区（位于K2与K3之间）有削弱作用，而L1连接区（位于K1与K2之间）和K3亚域对此无影响；FLC的K2亚域也会增强该作用，但K3亚域有削弱作用。SVP同源蛋白互作则需完整K域介导。而FLC同源蛋白互作仅需K1亚域介导，K2、K3亚域均有削弱作用。此外，也克隆了甘蓝FLC基因，并与芥菜SVP酵母双杂交，发现芥菜SVP依靠完整的K域能与甘蓝FLC相互作用，I域能增强该蛋白互作，但M域和C域可能会干扰该作用；当芥菜FLC被甘蓝FLC替换后，可明显增加作用强度。本研究结果为利用点突变或随机突变鉴定相互作用的氨基酸位点、根据特异性结构域和作用位点开发SVP-FLC蛋白复合物锁定或解聚的新型调控方法、决定开花信号整合子关闭（抑制开花）或开启（促进开花）等研究奠定基础。