小鼠胚胎干细胞中Cdk1和Oct4对Cdx2基因表达的调控

该申请课题所提出的假设是：Cdk1和Oct4结合形成蛋白质复合物，与Cdx2基因相结合，进而抑制Cdx2在ES细胞中的高表达。针对这一假设，我们已经完成工作及成果主要包括以下几方面：一、我们首次通过体内、体外实验证明了Cdk1和Oct4的相互作用。首先，采用过表达的方法进行了免疫共沉淀检测。我们将质粒pcDNAhygro-HA-Cdk1转染ES 细胞，4天后，提取细胞全蛋白进行免疫共沉淀试验。结果成功检测到ES细胞中Cdk1复合物中Oct4蛋白质的存在。同时，我们突变Cdk1的酶突变体，发现该突变并未影响Oct4与Cdk1的相互作用。其次，我们完成了内源Cdk1和Oct4蛋白质相互作用的检测。结果显示：Oct4蛋白质位于Cdk1复合体中。进而，GST pulldown实验证明了Cdk1和Oct4存在直接的相互作用，且该相互作用不依赖于Cdk1的激酶活性。另外，我们证明其它的Cdks不能和Oct4相互作用。我们纯化了GST–Cdk2和GST-Cdk4蛋白质，随后，分别将这些蛋白质和结合到His beads上的Oct4蛋白质孵育，结果发现这两个蛋白质均不能和Oct4相互作用，表明Oct4和Cdk1的相互作用并不普遍存在于Cdk蛋白家族。二、我们首次证明Cdk1通过转录调控机制，促进Oct4转录因子对Cdx2基因活性的抑制。首先，我们证明Cdk1尽管不能和Cdx2启动子直接结合，但却可以加强Oct4与Cdx2启动子的结合。我们纯化了Oct4和Cdk1的蛋白质，通过EMSA检测发现：Cdk1并不能直接与Cdx2启动子结合。然而有趣的是，随着Cdk1蛋白质量的增加，Oct4与Cdx2启动子的结合也随之增加。同时，当我们将Cdk1 knockdown时，Oct4与Cdx2启动子的结合也随之降低。其次，证明Cdk1抑制了Cdx2的基因活性。我们采用调节Cdk1表达水平合并荧光素酶报告基因检测技术的策略。将PGL4-Cdx2启动子质粒分别和Cdk1过表达质粒及Oct4过表达质粒共转染细胞。结果表明Cdk1表达量的提高增加了Oct4对PGL4-Cdx2启动子的抑制。重要的是，kinase-dead突变的Cdk1突变同样增加了Oct4对PGL4-Cdx2启动子的抑制，从而证明Cdk1对Cdx2的转录抑制不依赖于其激酶活性。三、染色质免疫共沉淀技术证明Cdx2为Cdk1的靶基因。