在完整细胞下进行三维超分辨荧光显微成像,进而获取亚细胞精细结构及各种动态过程的信息，一直是细胞成像研究的重要方向和难点。本项目紧密围绕厚样品的三维纳米分辨荧光显微成像展开研究，研究内容包括：开关分子开光特性研究；厚样品三维纳米分辨荧光显微成像相关基础理论问题研究；单分子三维定位算法及软件集成研究；成像系统的建立及生物学应用。. 通过四年的努力工作，项目组圆满完成了研究任务，达到了预期目标。本项目在以下四个方面取得重要进展：1）在成像方法方面，提出了利用单层平面照明激发（横向垂直照明、大入射角光学薄层照明）与双螺旋点扩散函数以及柱面镜像散轴向探测相结合的基于单分子定位的厚样品三维纳米分辨荧光显微成像方法，改善了厚样品成像时的信噪比，提高了成像深度和分辨率；基于变形光栅成像和双螺旋点扩散函数（DH-PSF）提出了一种大景深三维纳米分辨动态成像方法（DDCM），解决了大景深范围内多个分子同时成像和示踪的难题。2）在单分子定位算法方面，基于补零快速傅立叶变换和平均相位梯度算子，提出一种新型的噪声自由的频率域非迭代单分子快速定位算法（FDLA），该方法能够校正在空域而非时域快速变化的背景噪声，解决了厚样品超分辨成像中的背景干扰问题；基于压缩感知和柱面镜像散轴向定位提出了一种高密度三维单分子定位算法，相比传统的定位算法，定位密度提高了4-5倍，提高了成像速度。3）在核心器件研制方面，研制出具有DH-PSF与变形光栅双功能的高效复合相位片，为大景深多分子并行追踪和纳米分辨动态成像提供了具有自主知识产权的关键核心器件；基于四象限探测器研制了高精度实时反馈焦点防漂移装置，使显微成像系统轴向稳定性达到10nm，较已有产品提高了一个数量级。4）在系统搭建及生物学应用等方面，搭建完成基于单层平面照明的三维纳米分辨荧光显微成像系统，系统的3D分辨率达到了18-19-33nm（x-y-z），实现了完整细胞骨架的三维纳米分辨成像；成功搭建完成大景深三维纳米分辨动态成像系统，成功实现深度12微米内的三维运动荧光珠的纳米成像和示踪，初步研究了巨噬细胞的吞噬现象。. 通过本项目的研究，使我们初步认识到荧光纳米成像研究的重要性，借助这些荧光纳米分辨成像方法，将有望以纳米的分辨率研究完整活细胞内精细结构以及各种动态过程，极大地推进生命科学等领域的发展。