一个WNK1内含子编码microRNA在水泡性口炎病毒与宿主细胞相互作用中的调控及功能研究

为了探索miRNA在水泡性口炎病毒与宿主细胞相互作用中的调控作用，我们前期通过miRCURY LNA array筛选获得了一个新的VSV显著诱导的miRNA—miR-706。然而，由于对miR- 706的研究相对较少，其靶基因和该分子的功能仍有待确定。通过进一步研究发现，在VSV感染的BHK细胞，miR- 706能够通过降低caspase-3和-9的活性显著抑制VSV诱导的细胞凋亡，这一结果提示，VSV可能通过上调宿主细胞miR-706表达来拮抗来自宿主细胞的凋亡作用从而有利于病毒生存。为了筛选miR-706的细胞靶点，通过miRanda，RNAhybrid和TargetScan等多个生物信息学预测，我们最终锁定六个miR-706靶基因HOXA10、KPNA6、TGFBR1、DPF1、WNK1和CHL1做进一步的生物化学检测。通过化学合成靶基因3’UTR区段，成功获得6个荧光报告质粒。Luciferase检测结果表明，mmu-mir-706对Chl1 3’UTR (p<0.01)的表达有非常显著抑制作用；对Kpna6 3’UTR 的表达有显著抑制作用(p<0.05)。通过化学合成的方法分别将KPNA6-mut突变位点: GUUUCUC突变为CAACACU，CHL1-mut突变位点: GUUUCUC突变为CAACACU。Luciferase检测结果表明，mmu-mir-706对Chl1 3’UTR (p<0.01)的表达有非常显著抑制作用，而对经突变的Chl1 3’UTR没有抑制作用，这充分说明mmu-mir-706靶向Chl1是特异的。而后，通过real-time RT-PCR和Western blotting分别从转录水平和蛋白水平进一步证实了VSV感染BHK细胞后Chl1表达下调。本研究进一步探索了VSV基质蛋白M诱导的microRNA表达谱。通过对差异表达miRNA的靶基因进行GO分析和Pathway分析发现，差异表达microRNA靶基因参与多个细胞调控通路，像细胞凋亡通路、细胞周期通路，以及与感染和免疫密切相关的JAK-STAT通路、MAPK通路和趋化因子信号通路，提示VSV基质蛋白M可能在VSV与宿主细胞相互作用中扮演重要角色。总之，我们的研究结果表明，微RNA可能是参与VSV感染和免疫的重要基因调节子，其异常表达可以与VSV的感染和致病作用密切相关。