miRNA-338-5p抑制人骨髓基质干细胞成骨诱导分化致骨不连发生机制

目的： miRNA参与多种生物过程调控，特别与多种疾病发生有关。萎缩性骨不连是创伤骨科棘手的一类疾病，其发病机制不清，我们推测microRNA可能参与骨不连发生调控。方法：利用基因芯片检测萎缩性骨不连患者骨不连断端瘢痕修复组织和骨折患者骨折正常愈合后内固定钢板周围骨痂组织中miRNA表达谱，实时定量PCR加以验证。构建MG63细胞成骨分化模型，测试MG63细胞成骨分化过程特异miRNA表达谱变化。MG63细胞转染miR-628-3p双链RNA mimics继续诱导成骨分化，再检测MG63细胞的成骨能力的变化。利用生物信息学软件预测、双荧光素酶报告基因实验、实时定量PCR及Western Blot来验证miR-628-3p可能作用的靶基因。将miR-628-3p和siRUNX2双链RNA mimics分别转染MG63细胞并诱导其成骨分化，检测RUNX2蛋白的表达及成骨分化的表型。构建miR-628-3p和BMP2的双基因腺病毒载体转染MG63细胞进行体内外成骨研究。结果：萎缩性骨不连断端瘢痕修复组织中有9种miRNA表达上调和下调，其中miR-338-5p、miR-149、miR-221、miR-628-3p和miR-654-5p呈高表达并被数据库收录。实时定量PCR结果进一步证实。MG63细胞培养于成骨诱导液其成骨能力明显增强并呈时间依赖性，miR-338-5p和miR149无变化、miR-221表达先升高再降低，而miR-628-3p和miR-654-5p表达逐渐降低呈时间依赖性。转染miR-628-3p和miR-654-5p的MG63细胞继续成骨诱导，发现miR-628-3pMG63细胞成骨分化能力明显受抑制。生物信息软件预测及双荧光素酶报告基因证实，miR-628-3p可以直接作用于RUNX2的3’-UTR，miR-628-3p可显著抑制MG63细胞内源RUNX2 mRNA和蛋白的表达，miR-628-3p和siRUNX2双链RNA mimics可以抑制成骨诱导液增强RUNX2蛋白表达，两者对MG63细胞成骨分化抑制作用相似。通过构建腺病毒载体，体内外成骨实验证明miR-628-3p对BMP2诱导的MG63成骨分化过程具有明确的抑制作用。结论：miR-628-3p靶向RUNX2抑制成骨细胞的定向分化可能是萎缩性骨不连发生原因之一。