镉胁迫诱导拟南芥细胞内MLH1和MSH2基因突变及甲基化改变的分子机制

研究了Cd胁迫下拟南芥幼苗基因组DNA多态性、基因组甲基化以及DNA错配修复基因MLH1启动子甲基化的变化趋势。取得如下研究进展：.建立了一种改进的亚硫酸盐测序技术：基因组DNA经酶切纯化后，用亚硫酸盐修饰液修饰，将MLH1 基因启动子PCR产物克隆、测序后分析表明：与传统亚硫酸盐测序法相比，改进方法有利于DNA完全修饰；明显减少了修饰时间；提高了PCR的特异性、稳定性和重复性。该技术为DNA甲基化分析提供了一种更为理想的研究手段。该方法属于国内首次应用。.采用亚硫酸盐测序技术，分析了Cd 胁迫对拟南芥MLH1 基因启动子甲基化的影响：对405 bp扩增产物克隆测序得知，其含有11 个可发生甲基化的CpG 位点；0-3.0 ppm Cd 处理3 d 后，MLH1 启动子甲基化水平分别为9.1%、18.2%、27.3%、45.5%，且两者呈现出一定的正相关剂量-效应关系，表明MLH1 基因启动子甲基化可作为Cd胁迫的潜在生物标记物。采用亚硫酸盐限制酶技术表明：SalI、TaqI和Hpy99I均能够切割MLH1启动子405 bp片段中的首个CpG位点、亦能够切割405 bp PCR 产物中部分发生甲基化的CpG位点。例如，Hpy99I可以酶切对照405 bp PCR 产物Ibox中的CpG位点，产生353 bp切割片段；而Cd诱导了MLH1启动子区域Ⅱ box内CpG位点甲基化的产生，从而产生353 bp和226 bp切割片段，说明Cd诱导MLH1启动子甲基化水平上调。此研究为国际上该领域内的首次报道。.应用MSAP技术，证实了0-5.0 ppm Cd、Cu处理21天后，幼苗的MSAP比率分别为30.2%、34.7%、41.0%、33.9%、39.2%；甲基化多态性比例分别为2.6%、13.2%、2.4%、11.2%，Cd、Cu处理浓度与DNA甲基化水平和多态性之间呈显著正相关，可作为Cd、Cu胁迫的潜在生物标记物。.幼苗暴露于0–3.0 ppm Cd 26ｄ后，4对RAPD引物扩增出20–23个改变的RAPD片段;其中４个RAPD片段VCR, F-box,RPS3A,PGM与维持基因组稳定性密切相关；而且这些变化与Cd剂量之间存在剂量-效应关系;表明RAPD图谱变化可作为Cd胁迫的潜在生物标记物。此研究为国际上该领域内的首次报道。