超声激活原卟啉IX诱导人白血病细胞凋亡和细胞自噬性死亡的机制探讨

通过筛选SDT激活不同白血病细胞凋亡和自噬的最优实验参数组合，比较了不同白血病细胞对SDT应答效应的敏感性差异以及同一种细胞在SDT作用过程中所涉及的不同细胞死亡模式；重点研究了SDT诱导不同白血病自噬的相关理化因子临界阈值、作用靶点、信号转导途径和关键基因调控；采用加入自噬、凋亡特异性抑制剂，并结合RNA干扰技术，探讨了细胞自噬和凋亡在SDT抗肿瘤效应中的主导地位以及二者之间的密切联系及相互作用机制；阐明了不同白血病细胞在SDT作用下所产生的不同细胞死亡模式及相关分子生物学机制。.取得阶段性研究成果如下：.①检测到PpIX在K562、HL-60、U937中含量比PBMC高出约6-18倍，比其它正常组织来源的细胞也高出多倍，显示出PpIX在白血病细胞中特异性富集。利用MTG并结合共聚焦显微镜观察到PpIX在不同白血病细胞中主要定位于线粒体，提示线粒体可能是PpIX-SDT作用的主要靶点。.②超声强度和PpIX浓度的选择对SDT杀伤白血病细胞有着明显的差异，项目筛选出实验用SDT参数（对正常细胞损伤较小而又能有效诱导肿瘤细胞凋亡和自噬）：对于K562和U937细胞，选择1 W/cm2超声和2 μg/ml PpIX，对于HL-60细胞为1 W/cm2超声和0.1 μg/ml PpIX。.③在上述基础上，通过Annexin V/7-AAD双染、WB检测Caspase-3活化等方法证实SDT可诱导K562，HL-60，U937发生不同程度凋亡，线粒体-caspase依赖性凋亡通路在SDT抗肿瘤研究中起重要作用。SDT处理后胞内ROS显著升高，ROS清除剂NAC明显抑制Caspase-3活化和PARP剪切，保护了SDT诱导的细胞存活能力的下降，提示ROS在SDT诱导白血病细胞凋亡过程中起重要作用。.④通过WB检测LC3-II的剪切、eGFP-LC3基因转染、共聚焦显微镜观察LC3和Lamp2共定位等实验证实在所选定条件下SDT可诱导细胞自噬发生。.⑤通过自噬抑制剂3-MA/ Bafilomycin A1、凋亡抑制剂z-VAD-FMK及siRNA干扰自噬/凋亡关键基因等研究了SDT诱导肿瘤细胞自噬和凋亡间的关系，发现SDT诱导白血病细胞凋亡和自噬的发生呈时间依赖性。K562细胞中，自噬潮出现凋亡之前，用自噬特异性药物抑制剂可抑制自噬体的形成，增强SDT诱导的细胞凋亡