用新型非脂质体纳米颗粒介导的RNA干扰大规模筛选和鉴定卵母细胞减数分裂相关未知蛋白

RNA interference is one of the most important tools to study the function of unknown proteins in cell division. In mitosis of somatic cells, researchers can use liposome-mediated siRNA transfection or lentivirus-mediated shRNA gene knockdown to achieve phenotypic screen at "whole proteome" or "partial proteome" scale. While in meiosis of oocytes, by these means researchers couldn't generate efficient gene knockdown due to the blockage of pellucid zone, so they have to use microinjection, which is inefficient and harmful. In our proposal, based on previous successful trial at small scale (12 proteins), we plan to use novel non-liposomal nanoparticle-mediated siRNA gene knockdown to screen and functionally identify meiosis-related unknown proteins at larger scale (100 proteins). Through this, on the one hand we can testify whether this efficient, simple, harmless technique are still stable and reliable at a larger scale, thereby lay the foundation for the possible multi-institute collaborative study on the function of all the proteins in a certain meiotic process at "whole proteome" scale; on the other hand introduce it to other researchers so that we can go forward together and contribute to the progress of reproductive medicine in China.

RNA干扰是研究未知蛋白在细胞分裂过程中功能的最重要手段之一。在体细胞有丝分裂的研究中，研究者可用脂质体介导的siRNA、慢病毒介导的shRNA等基因敲降方法进行 "全蛋白组"或"局域蛋白组"式的大规模表型筛选。而在卵母细胞减数分裂的研究中，由于卵母细胞透明带的阻隔，这些手段都不能产生有效的基因敲降，因此只能用效率低、易损伤卵的显微注射法进行。本申请在成功的前期试验（12种蛋白）的基础上，提出用非脂质体的新型纳米颗粒介导的siRNA基因敲降来进行扩大规模（80种蛋白）的减数分裂相关蛋白的筛选和功能鉴定，一方面旨在检验这种高效、简便、无损伤的技术在更大规模的蛋白功能筛选中是否依然稳定可靠，为将来可能的多单位协作进行"全蛋白组"规模研究卵母细胞减数分裂中特定事件相关的所有未知蛋白奠定基础；另一方面随着研究的进展将该技术介绍给国内同行，实现协作共赢，从而为我国生殖医学研究的进一步提升贡献力量。

基因敲除动物已成为雌性生殖研究中探索未知基因或蛋白功能的必备技术。然而功能重要的基因敲除后大多情况下会导致卵巢功能低下（卵泡减少、卵泡不发育、卵泡凋亡等），故研究者经常面临的一个问题就是来自纯合敲除动物的卵母细胞细胞稀缺，实验周期长而进度缓慢。因此用RNA干扰在体外培养的卵母细胞上进行基因敲降或用抗体直接抑制内源蛋白的功能仍然是雌性生殖研究中一个重要的技术手段。但由于透明带的物理性阻挡，体细胞上广泛应用的各种高效的转染介质介导的siRNA或抗体转染还从未在卵母细胞上取得成功。因此，本项目旨在在成功的小规模（12种基因）前期试验的基础上，利用非脂质体的新型多肽纳米颗粒N-ter（Sigma公司）介导的、不需显微注射的siRNA转染方法在体外培养（IVM）的卵母细胞上进行基因敲降来进行扩大规模（100种基因）的减数分裂相关蛋白的筛选和功能鉴定。目前已成功建立了这一技术，从100种蛋白中成功筛选出16种进行进一步深入研究，其中Elmod2、Trim75、Plac1、Pnma5、ZP3及KBTBD8在IVM卵母细胞减数分裂及受精中的功能及作用机制的研究已发表，而还有Gm364、Fam70A&B、Fidgetin、Ankrd6、Oas1h及FBXW24已经完成在IVM卵上的工作，且已经成功制作了KO小鼠并正在深入进行动物水平的功能和机制研究。目前还有mphos6、Nlrp4e、Rbm10及Rrm2正在制作KO小鼠。目前我们已发表Sci论文5篇，其中IF＞5的Sci论文一篇，IF为3～5的Sci论文3篇，IF为2～3的Sci论文1篇。已被接收的IF＞5的Sci论文一篇。上述相关在研课题将在发表时继续标注本基金。在相关技术文章发表后已经有多位国内外生殖领域研究者试用了本技术，今后将利用各种交流机会继续进行本技术的交流推广工作。另外，还成功建立了类似的多肽纳米颗粒（Chariot）介导抗体转染入卵的方法。目前正在试验穿膜肽PEP1融合多肽在组织和动物水平高效入卵的方法。总之，在本基金支持下的研究成果将为雌性生殖研究做出重要贡献。

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